008

اصول کلی تکنیک SDS-PAGE

5/5 - (9 امتیاز)

اصول کلی تکنیک SDS-PAGE

تانک الکتروفورز عمودی – منبع تغذیه – جداسازی و تشخیص پروتئین – الکتروفورز عمودی –

الکتروفورز

فرایند حرکت مولکول های باردار در میدان الکتریکی است. در این فرایند خصوصیات فیزیکی و شیمیایی مولکول­ ها همچون میزان بار، اندازه، شکل و شرایط محیط اطراف آنها از قبیل نگه دارنده، جنس، قدرت یونی و pH بافر، درجه حرارت و مولفه­ های میدان الکتریکی (شدت جریان، ولتاژ و زمان الکتروفورز) موثر هستند. در میان روش ­های جداسازی مولکول­ ها الکتروفورز از توسعه یافته ­ترین و متنوع ترین روش­ها است. کارایی بسیار بالای الکتروفورز در جداسازی درشت مولکول­ ها (همچون پروتئین­ ها و اسیدهای نوکلئیک) و ریز مولکول­ها و حصول روش­ های بسیار حساس در تشخیص و مشاهده اجزای جدا شده، آن را به عنوان متداول­ ترین روش پایه­ ای مورد استفاده محققین مطرح ساخته است. تانک­ های الکتروفورز عمودی ساخت شرکت دنا ژن تجهیز در مدل ­ها و اندازه­ های مختلف قابل ارایه به محققین و متخصصین می­ باشد. این شرکت همچنین مدل ­های سفارشی و ویژه را طراحی و تولید می ­نماید. طراحی تمامی مدل­ها به گونه­ ای می­ باشد که نیاز به گیره و سیستم­ های قدیمی جهت تهیه ژل را مرتفع نموده است. در واقع در درون خود دستگاه ژل تهیه می­ شود و پس از آن ژل را در محفظه تانک قرار داده و دستگاه را جهت جداسازی مولکول­ ها به منبع تغذیه متصل می­ کنند.

رفتار پروتئین در میدان الکتریکی

پروتئین­ ها مولکول­ های چند یونی هستند که بسته به pH محیط می ­توانند دارای بار مثبت، منفی و یا خنثی باشند. بار هر پروتئین به دلیل یونیزه شدن گروه ­های آمین (NH2) و کربوکسیل (COOH) در ابتدا و انتهای مولکول و زنجیر جانبی (گروه R) اسیدهای آمینه بازی و اسیدی آن است. میزان یونیزه شدن گروه ­های قابل یونیزه متاثر از غلظت یون هیدروژن (H) محیط اطراف پروتئین است. علاوه بر این گروه ­ها، وجود مولکول ­هایی مانند قندهای دارای بار منفی و بنیان اسیدهای معدنی که در بسیاری از پروتئین­ ها پس از ترجمه افزوده می ­شود نیز تا حدود کمتری در تعیین بار خالص مولکول موثر است. با توجه به تاثیر pH محیط در میزان یونیزه شدن گروه ­های اسیدی و بازی، هر پروتئین دارای یک نقطه ایزوالکتریک (pI) منحصر به خود است. نقطه ایزوالکتریک نقطه ­ای از pH است که در آن بارهای مثبت و منفی موجود در ساختمان پروتئین با هم برابر و بار خالص مولکول صفر است. برای مثال نقاط ایزوالکتریک آلبومین سرم گاوی (BSA) و لیزوزیم سفیده تخم مرغ به ترتیب معادل 7/4 و 5/10 است. اگر پروتئین در pH پایین تر از pI خود قرار گیرد بار مثبت پیدا می­ کند. در این حالت پروتئین به عنوان کاتیون (یون مثبت) عمل کرده و در میدان الکتریکی به طرف کاتد (قطب منفی) حرکت می­ کند. در حالتی که پروتئین در pH بالاتر از pI خود قرار گیرد بار منفی پیدا می­ کند و به عنوان آنیون (یون منفی)عمل می­ نماید و در میدان الکتریکی به طرف آند (قطب مثبت) می رود. بدین لحاظ اگر در محیط دارای pH بازی تحت تاثیر میدان الکتریکی قرار گیرد، به طرف قطب مثبت حرکت می­ کنند. سرعت حرکت پروتئین­ ها در این حالت (حرکت آزادانه در محیط مایع) وابسته به میزان بار منفی آنها است. در حالتی که الکتروفورز در محیط­ های نگه دارنده همچون آگارز یا پلی اکریل آمید صورت گیرد، شکل و اندازه پروتئین از دیگر عواملی هستند که میزان حرکت مولکول را تحت تاثیر قرار می­ دهند.

اگر مخلوط پروتئینی در شیب مناسبی از pH تحت اثر میدان الکتریکی قرار گیرد هر جز آن به طرف یکی از قطب­ ها تا رسیدن به pH معادل نقطه ایزو الکتریک خود حرکت کرده، سپس در آن نقطه متمرکز و از بقیه اجزا جدا می ­گردد. این موضوع اساس جداسازی پروتئین­ ها در روش ایزوالکتریک فوکوسینگ است.

نقش بافر

نوع بافر و خصوصیات آن از قبیل قدرت یونی، ظرفیت بافری و pH از عوامل بسیار اساسی در الکتروفورز محسوب می­ شوند. جداسازی مولکول­ ها در الکتروفورز در یک بافر با pH معین و قدرت یونی خاص صورت می­ گیرد. قدرت یونی بافر باید تا حد امکان پایین بوده، بطوری که سهم یون­ های نمونه در برقراری جریان به اندازه کافی بزرگ باشد. بالا بردن غلظت یونی بافر به افزایش توان الکتریکی و گرما می ­انجامد. بدین لحاظ از نظر تئوری حداقل ظرفیت بافری که بتواند شرایط pH را ثابت نگه دارد.
و اثر pH نمونه را حذف کند برای الکتروفورز کافی است.

سیستم بافری پیوسته و ناپیوسته

سیستم بافری پیوسته به سیستمی اطلاق می­ گردد که در آن ترکیب یونی و pH بافر در سراسر مسیر الکتروفورز (نمونه، ژل و بافر مخازن) مشابه است. در مقابل در سیستم بافری ناپیوسته (چند قسمتی) ترکیب یونی و pH بافر در نمونه، ژل و مخازن با یکدیگر تفاوت دارد. در سیستم ناپیوسته حتی ژل نیز شامل دو قسمت است (ژل بالا و ژل پایین). این دو قسمت علاوه بر بافر از نظر اندازه منافذ نیز متفاوت هستند.

مزیت سیستم بافری ناپیوسته در این است که کارایی الکتروفورز آنچنان متاثر از حجم نمونه نیست. در این سیستم می­توان حجم­ های بالایی از نمونه­ های رقیق پروتئین را بطور مطلوب به اجرای آن تفکیک کرد. دلیل آن این است که پروتئین­ ها در طی حرکت در ژل بالا (ژل متراکم کننده) بصورت لایه­ های بسیار نازکی در می ­آیند و سپس در ژل پایین (ژل جدا کننده) به اجزای خو تفکیک می ­شوند.

در سیستم ناپیوسته نمونه پروتئین و ژل بالا حاوی بافر تریس-هیدروکلرید با 8/6 = pH، ژل پایین حاوی بافر تریس-هیدروکلرید با 8/8 = pH و بافر مخزن (بافر الکترودها) شامل تریس-گلیسین با 3/8 = pH می­ باشد.

با وجود مزایای سیستم­ های بافری ناپیوسته، الکتروفورز بعضی از پروتئین ­ها در شرایط طبیعی در این سیستم به تولید تجمعات پروتئینی نامحلول در ابتدای ژل جدا کننده منتهی می­ گردد. این تجمعات که در اثر متراکم شدن پروتئین­ ها در ژل بالا بوجود می ­آیند به تدریج در طی آزمایش حل شده و به حرکت می­ افتند و پس از رنگ آمیزی ژل به صورت خطوط یا ستون ­های عمودی رنگی، چهره الکتروفورز را مخدوش می ­سازند. در این موارد بهتر است الکتروفورز در سیستم بافری پیوسته انجام گیرد. از مزیت­ های دیگر سیستم بافری پیوسته این است که در شرایط بافری و بخصوص pH در تمام طول ژل و زمان آزمایش ثابت می­ ماند.
این موضوع در مورد الکتروفورز پروتئین ­هایی که به تغییر شرایط حساس هستند، اهمیت دارد.

سیستم بافری پیوسته اگرچه قابلیت تفکیک کنندگی ضعیف­ تری نسبت به سیستم بافری ناپیوسته دارد، با این حال با رعایت یک سری شرایط می ­توان پروتئین­ ها را به خوبی تفکیک کرد. کاهش حجم نمونه، رعایت غلظت پروتئین با توجه به حساسیت روش رنگ آمیزی و پایین بودن قدرت یونی بافر نمونه نسبت به ژل و بافر الکترود از جمله این شرایط است.

ژل پلی اکریل آمید

ژل پلی اکریا امید یک پلی مر بی­ بار و غیر فعال از نظر شیمیایی است که ظاهری شفاف دارد و در محدوده وسیعی از pH، درجه حرارت و شرایط بافری پایدار است. این ژل از ترکیب اکریل آمید و یک ماده رابط که معمولا بیس اکریل امید (به اختصار بیس) است، شکل می­ گیرد. بدین صورت مولکول ­های اکریل آمید به صورت طولی به هم متصل می­ شوند و ماده رابط نیز مسئول تولید پل­ های عرضی متعدد بین رشته ­های اکریل آمید است.

undefined

نتیجه این واکنش تشکیل شبکه ­ای است که در آن طول رشته­ های اصلی وابسته به غلظت نسبی اکریل آمید و تراکم اتصالات عرضی وابسته به غلظت بیس اکریل آمید است. پلیمریزاسیون اکریل آمید یک واکنش رادیکالی است که توسط پراکسید شروع می­ شود. در این روش پرسولفات آمونیوم به عنوان شروع کننده و TEMED به عنوان کاتالیزور عمل می­ کنند.

اکسیژن در پلیمریزاسیون اکریل آمید اثر مهاری دارد. بدین خاطر نمی­ توان ژل اکریل آمید را همچون آگارز روی سطوح شیشه­ ای سرباز تهیه کرد. تانک های الکتروفورز عمودی ساخت شرکت دنا ژن تجهیز در مدل­ ها و اندازه های مختلف قابل ارائه به محققین و متخصصین می­باشد. شرکت همچنین مدل ­های سفارشی و ویژه را طراحی و تولید می­ نماید.
طراحی تمامی مدل­ ها به گونه ­ای می ­باشد که نیاز به گیره و سیستم­ های قدیمی جهت تهیه ژل را مرتفع نموده است. در واقع در درون خود دستگاه ژل تهیه می­ شود و پس از آن ژل را در محفظه تانک قرار داده و دستگاه را جهت جداسازی مولکول­ ها به منبع تغذیه متصل می­ نمایند.

دمای مناسب واکنش پلیمریزاسیون 30 – 25 درجه سانتی گراد است. پلیمریزاسیون در دماهای بالاتر از 50 درجه سانتی گراد اگرچه سریع­ تر صورت می­ گیرد ولی به تولید رشته ­های کوتاه اکریل آمید فاقد خاصیت الاستیکی می ­انجامد.
برای طولانی ­تر کردن زمان پلیمریزاسیون می­توان محلول ها را خنک کرد و سپس به هم افزود یا مقدار مواد شروع کننده و کاتالیزور را کم نمود. بطور معمول سرعت پلیمریزاسیون باید به حدی باشد که زمان انعقاد ژل 60 – 20 دقیقه طول بکشد.

خصوصیات فیزیکی ژل از قبیل اندازه منافذ، خاصیت الاستیکی، چگالی ژل و قوام مکانیکی متاثر از غلظت دو جز تشکیل دهنده آن است. غلظت این اجزا در ژل پلی اکریل آمید با دو فاکتور درصد T (%T) و درصد C (%C) نشان داده می­ شود. درصد T، درصد حجمی / وزنی هر دو ماده اکریل آمید و بیس را نشان می­ دهد.

undefined = %T

در صد C، درصد وزنی بیس نسبت به هر دو مونومر را نشان می ­دهد.

undefined = %C

تفاوت انواع ژل­ هایی که از یک محلول استوک اکریل آمید و بیس اکریل آمید ساخته می­ شوند تنها در درصد T انها است. زیرا با رقیق کردن محلول استوک، درصد C ثابت می­ ماند و فقط درصد T تغییر می ­کند. با ثابت ماندن درصد C، هرچه درصد T کاهش یابد، اندازه منافذ ژل بزرگ تر می­ گردد.
با ثابت ماندن درصد C، هر چه درصد T کاهش یابد اندازه منافذ ژل بزرگ­ تر می­ گردد. با این حال ژل­ های کمتر از 5/2 درصد به دلیل عدم قوام مکانیکی قابل استفاده نیستند.

مولفه­ های الکتریکی الکتروفورز

در الکتروفورز اختلاف پتانسیل یا ولتاژ (V) نیروی اصلی حرکت دهنده مولکول­ های باردار است و سرعت حرکت مولکول­ ها به مقدار آن بستگی دارد. رابطه اختلاف پتانسیل با شدت جریان (I) و مقاومت الکتریکی (R) در قانون اهم امده است:

V = IR

مقاومت الکتریکی شامل مقاومت سیم­ ها، الکترودها، ژل و بافر است. اگر در الکتروفورز مقاومت را ثابت فرض کنیم. اختلاف پتانسیل و شدت جریان نیز ثابت خواهد ماند (قانون اهم). در عمل تغییر مقاومت الکتریکی یکی از دو مولفه ولتاژ یا شدت جریان (I) دچار تغییر می­گردد. به گرمای ژول معروف است. این گرما با معادله توان قابل محاسبه است.

P توان الکتریکی
(به وات) است: P=VI

در سیستم SDS-PAGE الکتروفورز در جریان الکتریکی ثابت با بالا رفتن مقاومت الکتریکی و گرما همراه است زیرا برای ثابت ماندن جریان، اختلاف پتانسیل باید به تدریج بالا رود. در این حالت ممکن است وجود سیستم خنک کننده برای حذف گرمای تولید شده لازم باشد، چرا که الکتروفورز در جریان الکتریکی بالا ممکن است به بی ­نظمی باندهای پروتئین، سوختن ژل یا ترک خوردن شیشه ­ های اطراف ژل منجر شود.

دستگاه تانک الکتروفورز عمودی شرکت دنا ژن تجهیز به صورت پکیج کاملی که شامل محفظه تانک، مادول ران کننده ژل، درب تانک، شیشه­ ها جهت تهیه ژل، شانه، سیم رابط، فاصله اندازها (spacer)، تخته ژل و کاردک جدا کننده ژل می­ باشد. مادول ران کننده ژل به گون­ه ای می­ باشد که به صورت مستقیم ژل ریزی صورت می­ گیرد و دستگاه جهت جداسازی مولکول ها در تانک قرار می ­گیرد. ژل الکتروفورز صفحه­ ای را می ­توان به انواع عمودی و افقی تقسیم کرد. در الکتروفورز صفحه ­ای عمودی ژل بین دو صفحه شیشه­ ای قرار دارد و با مخازن بافر، از بالا و پایین در ارتباط است این نوع ارتباط باعث می­ شود تا از میدان الکتریکی اعمال شده حداکثر استفاده به عمل آید. احتمال نشت بافر و خطرات الکتریکی به ویژه در ولتاژهای بالا از مشکلات این نوع الکتروفورز است. ژل ­های صفحه ای عمودی ممکن است از چند صدم میلی متر تا چند میلی متر ضخامت داشته باشد. شرکت دنا ژن با توجه به نیاز مشتری از دستگا­ه هایی برای تهیه ژل با ضخامت های مختلف تولید می­کند.
جهت راحتی عمل تهیه ژل spacer دستگاه­ ها به صورت پیش فرض به شیشه مربعی چسبیده است. این اسپیسر دارای ضخامت 1 میلی متر می ­باشد. در صورت نیاز مشتری به spacer های با ضخامت دیگر، می­توان قبل از فرستادن دستگاه آن را سفارش داد. سیم­ های رابط دستگاه الکتروفورز عمودی به گونه­ ای طراحی شده­ اند که با کلیه منبع تغذیه ­ های روتین مورد استتفاده در آزمایشگاه قابلیت اتصال دارند. سیستم سیرکولاتور موجود در دستگاه قابلیت حفظ دمای محفظه و جلوگیری از گرم شدن دمای محفظه را دارد و نیاز به سیستم چیلر جهت خنک شدن را مرتفع می­ نماید. همراه هر دستگاه دو عدد شانه روتین تانک ­های الکتروفورز عمودی می­ باشد. اما در صورت نیاز به شانه سفارشی و یا شانه­ های بیشتر لازم است قبل از ارسال دستگاه ، با شرکت دنا ژن هماهنگ شود.

undefined

این نوع ژل­ ها و دستگاه­ ها در اندازه ­های مختلف مورد استفاده قرار می گیرند. شرکت دنا ژن انواع مدل در اندازه های مختلف را تولید می ­کند. مشخصات فنی دستگاه الکتروفورز عمودی در جدول زیر مشاهده می­ شود.

undefined

اگر الکتروفورز صفحه ای افقی در ژل پلی اکریل آمید صورت گیرد ابتدا عمل پلیمریزاسیون ژل بین دو صفحه شیشه­ ای انجام می ­ گیرد (مشابه ژل عمودی). این موضوع به دلیل حساس بودن واکنش پلیمریزاسیون به اکسیژن است. بعد از آماده شدن ژل یکی از صفحات شیشه­ ای برداشته شده سپس نمونه گذاری و الکتروفورز در حالت افقی صورت می­ گیرد. ژل ­های افقی معمولا در بافر غوطه ­ور می ­شوند و بیشتر با هدف جداسازی قطعات نوکلئوتیدی صورت می­ گیرد. ارتباط ژل و بافر در این حالت مستقیم است و الکتروفورز در زیر لایه ه­ایی از بافر صورت می­ گیرد.

مواد تسهیل کننده حلالیت پروتئین­ها در الکتروفورز

بطور کلی پروتئین­ هایی که به راحتی محلول نیستند و یا در طی آزمایش دچار واکنش ­های بین مولکولی می­ گردند و به هم می ­چسبند، در روش­های الکتروفورز به سادگی تفکیک نمی­ شوند. در چنین حالاتی افزودن موادی که به حلالیت آنها کمک نماید، اهمیت پیدا می­ کند. اوره از موادی است که برای جلوگیری از لخته شدن پروتئین­ ها و حل کردن لخته بکار می­ رود. این ماده بار الکتریکی پروتئین ها را تغییر نمی­ دهد و در غلظت­ های کم بسته به نوع پروتئین تاثیر چندانی در ساختمان پروتئین ندارد ولی در غلظت­ های بالاتر پروتئین را واسرشته می ­کند. ساختار سه بعدی بسیار از پروتئین ها در غلظت 8 مولار اوره از هم باز می ­شود. در چنین حالتی حرکت الکتروفورزی پروتئین نسبت به شکل طبیعی آن کندتر می­ گردد. این موضوع یکی از روش­ های بررسی تغییر ساختمان پروتئین است. اوره را بطور معمول به ژل متراکم کننده، ژل جدا کننده ونمونه می­ افزایند ولی آن را به بافر الکترود اضافه نمی­ کنند. غلظت اوره در ژل معمولا کمتر از غلظت ان در نمونه است (برای مثال غلظت 4 مولار در ژل­ها و 8 مولار در نمونه).

دترجنت­ ها از مواد متداول و موثر در افزایش حلالیت پروتئین­ ها بویژه پروتئین­ های غشایی هستند. این مواد در حفظ پیوندهای آبگریز بسیار کارامد هستند. این پیوندها در برهم کنش پروتئین ­ها با همدیگر و پروتئین ­ها با لیپیدها موثرند. لذا دترجنت­ ها از مهم ترین مواد در محلول سازی پروتئین­ های غشایی محسوب می­ شوند. دترجنت­ های غیر یونی را در غلظت 5 –1/0 درصد وزنی حجمی در ژل و نمونه بکار می ­برند. دترجنت ­های انیونی و کاتیونی بار الکتریکی پروتئین را تغییر می­ دهند و معمولا ساختمان آن را واسرشته می­ کنند. این دترجنت ها در شرایط طبیعی در الکتروفورز پروتئین­ ها کاربردی ندارند.

برچسب ها:

Add a Comment

Your email address will not be published. Required fields are marked *