005

همه چیز راجب تکنیک بلاتینگ

5/5 - (8 امتیاز)

تکنیک بلاتینگ

تانک الکتروفورز عمودی – جداسازی و تشخیص پروتئین –

مواد لازم جهت انجام تکنیک ایمونوبلات

1- غشای نیتروسلولز با اندازه منافذ 45/0 میکرومتر یا غشای ایموبیلون (PVDF)

2- بافر انتقال حاوی تریس 25 میلی ­مولار، گلیسین 192 میلی­ مولار و متانول 15 درصد. برای تهیه آن 6 گرم تریس باز و 8/28 گرم گلیسین را در حدود یک لیتر آب مقطر حل کنید. سپس 200 میلی­ لیتر متانول اضافه کنید، حجم نهایی را با آب مقطر به 2 لیتر برسانید (PH این محلول حدود 3/8 است و نیازی به تنظیم ندارد). بافر را در یخچال قرار دهید تا قبل از استفاده خنک گردد، چون حل شدن متانول در آب گرمازاست.

3- کاغذ واتمن یا کاغذ الکتروفورز

روش آزمایش

1- مقداری از بافر تانک را در یک ظرف پلاستیکی یا شیشه­ ای تمیز بریزید. ژل را پس از بریدن بخش متراکم کننده آن حداقل 10
دقیقه در بافر قرار دهید.

نکته 1: ژل در این مدت به تعادل بافری میرسد. اگر ژل به تعادل بافری نرسد، جمع شدن آن هنگام انتقال صورت گرفته و باندهای
پروتئینی انتقال یافته به صورت اسمیر در می ­آیند. اگر بافر الکتروفورز بسیار متفاوت از بافر انتقال باشد، زمان بیشتری برای به تعادل رسیدن ژل لازم است. در ضمن باید توجه داشت که اگر درصد ژل بسیار کم باشد، قرار دادن آن به مدت طولانی در بافرانتقال ممکن است به انتشار و خروج پروتئین­ ها بیانجامد.

2- با کمک پنس و قیچی تمیز، یک ورقه از غشا به اندازه ژل ببرید. از تماس دست بدون دستکش با غشا خودداری کنید. غشا را با آب مقطر (برای غشای نیتروسلولز) یا متانول (برای غشای PVDF) خیس کنید و در ظرف حاوی بافر انتقال دهید. چندین لایه کاغذ صافی متناسب با ابعاد
ژل تهیه و همراه اسفنج­ها در بافر خیس کنید. سپس مطابق شکل زیر اجزای گفته شده را روی هم قرار دهید. این مجموعه از پایین به بالا شامل اسفنج، چند لایه کاغذ صافی، ژل، غشا، چند لایه کاغذ صافی و لایه اسفنج می­باشد. بعد از گذاشتن هر لایه، حباب­ های
هوای احتمالی را با یک میله شیشه­ ای یا لوله آزمایش از حد فاصل لایه ­ها خارج کنید.

نکته 2: اگر ژل و غشا کاملا به هم نچسبند، پروتئین­ های جدا شده از ژل بطور دقیق منتقل نمی­ شوند و به حالت اسمیر در می آیند.
در ضمن حباب هوا بین ژل و غشا از انتقال پروتئین در آن نقاط جلوگیری می کند.

undefined

شکل 5. انتقال به روش تر

3- مجموعه بلات را در قاب پلاستیکی مربوطه محکم کنید و در تانک بلات که تا ارتفاع مناسب با بافر پر شده است، قرار دهید. سپس به مدت 1-4 ساعت در شدت جریان 200-400 میلی آمپر الکتروفورز نمایید.

نکته 3: مدت زمان مطلوب راب انتقال به عواملی مثل شدت جریان، اندازه پروتئین­ ها، درصد و ضخامت ژل و ترکیب بافر (قدرت یونی، درصد متانول و وجود دترجنت­ها) بستگی دارد. هر چه وزن مولکولی پروتئین، غلظت و ضخامت ژل و درصد متانول کمتر باشد زمان کمتری برای انتقال نیاز است. به این دلیل زمان مطلوب برای انتقال تجربی است. انتقال به مدت 2 ساعت در شدت جریان 3/0 آمپر می ­تواند مبنای مناسبی برای شروع باشد.

نکته 4: دمای 25 – 15 درجه سانتی گراد در اغلب موارد برای انتقال مناسب است. در حالتی که دستگاه بلات فاقد سیستم خنک کننده است، بهتر است انتقال در سردخانه یا یخچال و یا در جریان الکتریکی ضعیف تر انجام شود. می­ توان این کار را در طول شب با ولتاژ 20- 10 ولت انجام داد.

انتخاب بافر در الکتروبلات

انتخاب بافر و استفاده از متانول در بافر بستگی به نوع پروتئین­های مورد مطالعه، شرایط ژل، نوع الکتروفورز و نوع غشا دارد. همان­گونه که قبلا ذکر شد، بافر تریس-گلیسین برای انتقال اغلب پروتئین ­ها مناسب می­ باشد. پروتئین­ ها در این بافر معمولا بار منفی دارند و به طرف آند حرکت می ­کنند. اتصال SDS به پروتئین­ ها (برای مثال در SDS-PAGE) نیز به تشدید بار منفی و حرکت آنها
کمک می­ کند. با این حال در بعضی موارد تغییر شرایط بافر تریس-گلیسین یا انتخاب بافر دیگر می­ تواند انتقال را تسهیل نماید. به عنوان مثال، تجربه نشان می­ دهد که با حذف متانول در بافر تریس-گلیسین انتقال گلیکوپروتئین­ های بزرگ به راحتی صورت می ­گیرد. متانول با زدودن SDS از پروتئین­ ها و جمع­ کردن ژل باعث کاهش انتقال این مولکول­ ها می­ شود. SDS یک دترجنت آنیونی است و در انتقال پروتئین ­ها (خصوصا پروتئین­ های با بار خالص مثبت) تاثیر­گذار می­ باشد. بنابراین در صورت نیاز، علاوه بر حذف
متانول، می­توان درصد بسیار کمی از آن را وارد بافر کرد.

انتقال در بافر CAPS50میلی مولار سریعتر صورت می­ گیرد و با تولید گرمای کمتری همراه است. بدین لحاظ در صورت لزوم می­توان از این بافر به جای تریس-گلیسین استفاده کرد. در حالاتی که بلاتینگ به هدف تعیین توالی اسیدهای آمینه در پروتئین ­ها
صورت می­ گیرد، بافر CAPS مناسب تر است؛ زیرا حضور گلیسین در بافر موجب اختلال در تعیین توالی پروتئین­ ها می ­شود.

بافر بورات سدیم 10 میلی­ مولار با PH=9.2 برای انتقال گلیکو پروتئین ­ها، پلی­ ساکاریدها و لیپوپلی­ ساکاریدها توصیه می ­شود. در
این بافر، بورات به واحدهای قندی مواد فوق متصل می­ شود و به آنها بار منفی می­ دهد.

پروتئین ­های بازی که در شرایط اسیدی الکتروفورز می ­شوند، یا پروتئین­ هایی که با تکنیک ایزوالکتروفوکوسینگ جدا می­ شوند، را می ­توان در محلول اسید­استیک 7/0درصد به غشا انتقال داد. در این شرایط پروتئین­ ها بار مثبت دارند و به طرف قطب
منفی حرکت می ­کنند.

undefined

بعد از بلاتینگ پروتئین­ ها لازم است اطلاعاتی در مورد کیفیت و کمیت باندهای انتقال یافته بدست­ آید، یا پروتئین خاصی به هدف
مطالعات بعدی (مثلا تعیین توالی) مشخص گردد.

برای این کار می­توان غشای نیتروسلولز یا PVDF را با مواد مختلف رنگ­آمیزی نمود. رنگ­ آمیزی پروتئین­ ها بسته به هدف آزمایش ممکن است به صورت قابل برگشت و یا غیر قابل برگشت باشد. پانسو-اس، جوهر­هندی، آمیدوبلک و کوماسی آبی از مواد متداول برای رنگ ­آمیزی عمومی پروتئین ­ها در غشا هستند. رنگ­ آمیزی ژل نیز کامل یا ناقص­ بودن انتقال پروتئین ­ها را نشان می­ دهد. باندهای پروتئین در ژل و غشا دقیقا هم موقعیت نمی­ باشند، زیرا ژل در طی متعادل­ سازی در محلول انتقال به دلیل وجود متانول،
مقداری کوچک می ­شود.

رنگ آمیزی قابل برگشت با پانسو- اس

محلول رنگ ­آمیزی شامل پانسو-اس 1/0 درصد وزنی- حجمی در اسید استیک 5 درصد حجمی – حجمی است. محلول آماده آن نیز توسط شرکت­ های مختلفی عرضه م ی­شود. برای رنگ آمیزی غشا را به مدت 5-10 دقیقه در مقدار کافی محلول رنگ قرار دهید. سپس با آب مقطر بشویید تا زمینه غشا بی­ رنگ گردد.

باندهای پروتئینی بعد از رنگ آمیزی به رنگ قرمز در می ­آیند. اگر شستشو با آب ادامه یابد، باندها نیز بی رنگ می­ گردند. رنگ آمیزی با پانسو-اس دخالتی در تشخیص باندها به روش اختصاصی (مثلا ایمونوبلاتینگ) یا در تعیین توالی اسیدآمینه ها ندارد. حساسیت این روش نسبتا پایین می ­باشد.

رنگ آمیزی قابل برگشت با آمیدوبلک

محلول رنگ آمیزی شامل آمیدوبلک با غلظت 01/0 درصد وزنی – حجمی در آب مقطر می ­باشد. برای رنگ ­آمیزی، غشا را 20-30 دقیقه در مقدار کافی محلول رنگ قرار دهید. سپس با آب بشویید تا زمینه غشا بی­ رنگ گردد. رنگ باندهای پروتئینی به تدریج ضعیف و بالاخره ناپدید می ­شود.

رنگ آمیزی غیر قابل بازگشت با کوماسی بلو

محلول رنگ ­آمیزی شامل کوماسی بلو R-250با غلظت 1/0 درصد وزنی حجمی در محلول اسید استیک 7 درصد حجمی- حجمی و متانول 50 درصد حجمی- حجمی در آب مقطر است.

محلول رنگ بر شامل اسید­استیک 7 درصد و متانول 50 درصد در آب مقطر است. رنگ آمیزی ژل با کوماسی بلو نیز با همین محلول­ ها صورت می­ گیرد.

غشا را 15 دقیقه در مقدار کافی محلول رنگ قرار دهید.محلول رنگ را تخلیه کرده، غشا را در محلول رنگ بر بشویید تا زمینه آبی آن بی­ رنگ گردد. سپس غشا را در آب مقطر بشویید.

کوماسی بلو برای رنگ­آمیزی پروتئین ­ها در PVDFمناسب است. این نوع رنگ را برای رنگ آمیزی نیتروسلولز بکار نبرید. زیرا زمینه آن شدیدا رنگی می ­شود.

رنگ­ آمیزی غیر قابل برگشت با آمیدوبلک

محلول رنگ ­آمیزی شامل آمیدوبلک آمیدوبلک 5/0درصد وزنی حجمی، اسید استیک 5 درصد حجمی- حجمی و متانول 50درصد
حجمی- حجمی در آب مقطر است.

محلول رنگ­بر شامل اسید استیک 5 درصد و متانول 50درصد در آب مقطر است.غشا را 5 دقیقه در محلول رنگ بر قرار دهید. محلول رنگ­ آمیزی را تخلیه کنید و غشا را با محلول رنگ­بر بشویید تا زمینه آبی رنگ شود.

رنگ آمیزی مارکرهای پروتئینی

تعیین برخی از خصوصیات پروتئین­ها همچون اندازه یا نقطه ایزوالکتریک (PI) با استفاده از مارکر­های پروتئینی صورت می ­گیرد. برای تشخیص مارکرها در غشا می­توان از روش­های زیر کمک بگیرید.

1- قسمت مربوط به مارکرها را از بقیه غشا جدا نمایید و با یکی از روش های غیر قابل برگشت که در صفحات قبل به آنها اشاره شد، رنگ­ آمیزی نمایید (PVDF را با کوماسی و نیتروسلولز را با آمیدوبلک رنگ کنید)؛ سپس این بخش از غشا را خشک نمایید و در کنار بقیه نتایج قرار دهید.

2- بسته به نوع برند موقعیت مارکرها و تعداد باندشان متفاوت است.

3- می­توان شکل بیوتینه شده مارکرها را تهیه کرد و یا مارکرها را در آزمایشگاه به بیوتین متصل نمود. تحت چنین شرایطی با در اختیار داشتن کونژوگه آویدین-پراکسیداز یا آویدین و کونژوگه آنتی­آویدین-پراکسیداز می ­توان موقعیت مارکرها را مشخص نمود.

4- آلبومین مرغی و آلبومین گاوی از پروتئین­هایی هستند که در بسیاری از انواع مارکرها وجود دارند. با در اختیار داشتن آنتی­بادی ضد این دو پروتئین به صورت کانژوگه با آنزیم (یا آنتی­بادی ضد آنها و آنتی­بادی ثانویه کانژوگه) می­ توان موقعیت آنها را در غشا تعیین ساخت. این روش زمانی قابل اجرا است که از این پروتئین­ ها به عنوان ماده مسدود­کننده در غشا استفاده نشود.

برچسب ها: بدون برچسب

Add a Comment

Your email address will not be published. Required fields are marked *