006

رفع اشکالات الکتروفورز

5/5 - (1 امتیاز)

رفع اشکالات الکتروفورز SDS PAGE (الکتروفورز پروتئین)

تانک الکتروفورز افقی – تانک الکتروفورز عمودی – منبع تغذیه – جداسازی و تشخیص پروتئین – جداسازی و تشخیص dna –

رفع اشکالات الکتروفورز

در ذیل مشکلات روتین و معمول که برای الکتروفورز PAGE پیش می­ آید را به همراه دلیل مشکل و روش حل آن ارایه شده است.

اشکال: عدم پلیمریزاسیون یا پلیمریزاسیون ناقص

علت: پایین بودن دمای محلول­ها

راه­کار : قبل از استفاده لازم است دمای محلول به دمای محیط برسد (30 -20 سانتیگراد).

علت: کهنگی یا کم بودن مقدار کاتالیزورها مخصوصا آمونیوم پرسولفات

راه­کار : محلول تازه آمونیوم پر سولفات تهیه شود. مقدار بیشتری به ژل اضافه شود.

علت: کهنه بودن استوک اکریل آمید

راه­کار : محلول تازه اکریل آمید تهیه گردد.

علت: غلظت بالای ماده احیا کننده 2- مرکاپتواتانل

راه­کار : در صورت امکان 2- مرکاپتواتانل را در غلظت کم به ژل اضافه کنید. یا آن را در محلول ژل وارد نکنید.

علت: اثر اکسیژن هوا بخصوص در محلول­های سرد

راهکار: دمای محلول ­ها به دمای محیط برسد.

محلول ژل هواگیری شود.

اشکال: منعقد نشدن بخشی از ژل اکریل آمید در قالب شیشه­ای

علت: مخلوط نشدن آمونیوم پرسولفات در محلول ژل مخصوصا در ژل­های غلیظ

راهکار: بعد از افزودن آمونیوم پرسولفات به محلول آن را کاملا مخلوط کنید.

اشکال: جدا شدن ژل از شیشه

علت: کثیف بودن سطح شیشه

راهکار: سطح شیشه را کاملا تمیز کنید.

مشکل: چروکیده شدن ژل

علت: گرمای زیاد در هنگام الکتروفورز به دلیل مقاومت الکتریکی

راهکار: سیستم با گردش آب خنک گردد یا الکتروفورز در جریان الکتریکی کمتر و در مدت طولانی­ تر صورت گیرد.

علت: بالا بودن ضخامت یا درصد ژل در هنگام خشک کردن یا قطع جریان برق در هنگام خشک شدن ژل در دستگاه خشک کن

راهکار: قبل از خشک کردن ژل را نیم ساعت در محلول حاوی متانول 30 – 20 درصد و گلیسرول 3 درصد قرار دهید.

مشکل: چاهک­ های نامنظم و ناقص در ژل بالا (ژل متراکم کننده)

علت: محبوس شدن انتها یا کناره­ های دندانه شانه

راهکار: شانه را خارج ساخته و مجددا در در محل خود قرار دهید به نحوی که حباب هوا نداشته باشد.

علت: خارج ساختن شانه قبل از کامل شدن انعقاد ژل بالا

راهکار: پس از اطمینان از انعقاد ژل بالا اقدام به خارج کردن شانه کنید.

چاهک ها را با بافر الکترود بشویید.

مشکل: قرار نگرفتن نمونه در ته چاهک

علت: عدم وجود گلیسرول یا ساکارز در بافر نمونه

راهکار: به بافر نمونه گلیسرول یا ساکارز اضافه کنید.

مشکل: جاری شدن نمونه در چاهک­ های کناری

علت: بزرگ تر بودن ضخامت spacerها نسبت به ضخامت شانه

راهکار: در هنگام تهیه ژل از شانه مناسب استفاده شود.

علت: سر ریز شدن چاهک­ ها از نمونه

راهکار: حدود یک دوم تا یک سوم چاهک را از نمونه پروتئین بریزید.

مشکل: وجود باند قوی در ابتدای ژل جدا کننده

علت: وجود تجمعات بزرگ و نامحلول پروتئین یا لیپوپروتئین در نمونه (مخصوصا در PAGE)

راهکار: نمونه را قبل از الکتروفورز نمونه را min 15 در g 20000 سانتریفیوژ نمایید. الکتروفورز را در حضور مواد تسهیل کننده حلالیت پروتئین ها انجام دهید.

علت: وجود ژل متراکم کننده (معمولا در PAGE)

راهکار: در سیستم بافری پیوسته الکتروفورز را انجام دهید.

علت: بالا بودن درصد ژل نسبت به وزن مولکولی عده­ ای از پروتئین­ های موجود در نمونه

راهکار: در صورت امکان درصد ژل را پایین آورید. یا الکتروفورز را در ژل با شیب غلظت انجام دهید.

علت: کاهش غلظت SDS یا ماده احیا کننده (در SDS-PAGE)

راهکار: غلظت SDS یا ماده احیا کننده را در بافر نمونه افزایش دهید.

یا در صورت امکان نمونه پروتئین را رقیق کنید تا نسبت غلظت آن با SDS و ماده احیا کننده متناسب گردد.

علت: پایین بودن pH نمونه (بخصوص بعد از رسوب با تری­ کلرو استیک اسید)

راهکار: pH نمونه را تنظیم کرده یا در مقابل بافر مناسب دیالیز کنید.

قبل از الکتروفورز نمونه را min 15 در g 20000 سانتریفیوژ نمایید.

مشکل: باندهای نامنظم و مواج

علت: وجود حباب هوا در ژل

راهکار: محلول ژل را هواگیری نمایید.

علت: ناهمگونی اندازه منافذ ژل

راهکار: محلول ژل را کاملا مخلوط نمایید، مقدار آمونیوم ­پرسولفات را تنظیم نمایید تا زمان انعقاد ژل متناسب گردد.

علت: لرزش قالب شیشه ­ای در هنگام انعقاد ژل

راهکار: قالب ژل را کنار دستگاه های لرزاننده قرار ندهید.

علت: ادامه پلیمریزاسیون ژل در چاهک­ ها پس از خارج ساختن شانه

راهکار: پس از انعقاد کامل ژل بالا و خارج نمودن شانه، چاهک­ ها را با بافر الکترود شستشو دهید.

علت: بالا بودن غلظت نمک در نمونه

راهکار: نمونه را با بافر نمونه (1X) رقیق کرده یا در مقابل بافر مناسب دیالیز نمایید.

مشکل: وجود ستون­ های رنگی با باندهای نامشخص یا کاملا تفکیک نشده

علت: وجود غلظت بالای موادی همچون کلرید گوانیدیوم در نمونه

راهکار: در صورت امکان نمونه را رقیق کنید.

کلرید گوانیدیوم را با ترکیبات سازگار همچون اوره تعویض کنید.

مشکل: خطوط رنگی در مسیر الکتروفورز در ستون­ ها

علت: حل شدن تدریجی توده ­های مولکولی موجود در نمونه

راهکار: قبل از الکتروفورز نمونه را min 15 در g 20000 سانتریفیوژ نمایید.

مشکل: وجود باندهای کاذب در تمام ستون­ ها یا در سراسر عرض ژل

علت: اثر بتامرکاپتواتانول پس از رنگ آمیزی ژل با نقره آمونیاکی (به صورت دو باند منتشره در موقعیت­ های 50 و 67 کیلودالتون)

راهکار: بجای بتا مرکاپتو اتانول از DTT استفاده نمایید.

یا ژل را به روش دیگری رنگ آمیزی کنید.

علت: آلوده شدن بافر نمونه

راهکار: بافر نمونه تازه تهیه کنید.

علت: وجود ناخالصی در بافر مخزن بالا (در الکتروفورز عمودی)

راهکار: از مواد شیمیایی با خلوص و کیفیت بالا برای تهیه بافرها استفاده کنید. ترجیحا از بافرها مجددا استفاده نکنید.

مشکل: عدم تکرار پذیری نتایج الکتروفورز

علت: پروتئولیز نمونه در هنگام استخراج یا نگهداری آن

راهکار: استخراج نمونه در دمای پایین و در حضور مهارکننده­ های پروتئاز صورت گیرد.

نمونه در شرایطی نگهداری شود که دچار حداقل تغییرات گردد.

علت: متناسب نبودن مقدار SDS و یا ماده احیا کننده در بافر نمونه نسبت به پروتئین (در SDS-PAGE)

راهکار: غلظت SDS یا ماده احیا کننده را در بافر نمونه افزایش دهید.

یا در صورت امکان نمونه پروتئین را رقیق کنید تا نسبت غلظت آن با SDS و ماده احیا کننده متناسب گردد.

علت: تغییر در روش یا شرایط رنگ آمیزی

راهکار: ژل ­ها را با یک روش ثابت رنگ آمیزی کنید.

مشکل: تبلور اوره در ژل

علت: پایین بودن درجه حرارت

راهکار: الکتروفورز در دمای 15 درجه سانتی گراد انجام شود.

مشکل: ضعیف بودن باندها

علت: سرعت زیاد الکتروفورز

راهکار: ولتاژ کاهش داده شود.

یا بافر بیش از حد رقیق است. غلظت بافر افزایش داده شود.

علت: حل نشدن باندهای پروتئین

راهکار: زمان الکتروفورز طولانی­ تر شود.

یا اندازه منافذ ژل برای پروتئین­ هایی که باید جدا شوند صحیح نیست. از ژل با درصد اکریل آمید متفاوت استفاده شود.

علت: حجم نمونه بیش از حد زیاد است.

راهکار: غلظت پروتئین را افزایش دهید.

علت: ژل بیش از حد کهنه است.

راهکار: از ژل­ های تازه استفاده کنید.

مشکل: اسمیر (smear) شدن باندها

علت: ولتاژ استفاده شده بسیار زیاد است.

راهکار: ولتاژ را کاهش دهید.

علت: غلظت پروتئین بیش از حد زیاد است.

راهکار: مقدار پروتئین load شده در ژل را کاهش دهید.

علت: غلظت نمک بیش از حد زیاد است.

راهکار: نمونه­ ها را دیالیز کنید.

علت: بافر تانک کهنه است.

راهکار: بافر تانک تازه استفاده کنید.

علت: زمان رنگ بری کوتاه است.

راهکار: مدت زمان رنگ بری را افزایش دهید.

برچسب ها:

Add a Comment

Your email address will not be published. Required fields are marked *