004

تکنیک های مولکولی و ترابلشوتینگ

مواردی که باید در طراحی پرایمر اجتناب کرد

تانک الکتروفورز افقی – real time pcr – gel documentation – جداسازی و تشخیص dna – رنگ dna – ترانسلومیناتور UV – ترانسلومیناتور – geldoc – الکتروفورز افقی – ژل داکیومنت – ریل تایم –

…………………………………………

مواردی که در هنگام طراحی پرایمر باید از آنه ا اجتناب کرد در ادامه توضیح داده خواهند شد. عدم رعایت این موارد کارایی و اختصاصیت پرایمر طراحی شده را بشدت کاهش می­ دهند. این موارد شامل وجود ساختارهای ثانویه، توالی­ های تکراری و وجود تکرارهای چندتایی از یک نوکلئوتید است.

شرکت دنا ژن تولید کننده انواع تجهیزات مولکولی از جمله ژل داکیومنت، الکتروفورز افقی و الکتروفورز عمودی می باشد.

در این وبلاگ قرار است شرکت دنا ژن به صورت مر تب کلیه تکنیک های مولکولی و ترابلشوتینگ آنها را توضیح دهد.

1- ساختارهای ثانویه (Secondary Structures)

ساختارهای ثانویه در اثر برهمکنش‌های بین مولکولی و درون مولکولی ایجاد می‌شوند و یک یا هر دو پرایمر را از دسترس آنزیم پلیمراز خارج می‌کنند. این مسئله موجب کاهش چشم گیر میزان محصول خواهد شد .اولین ساختار ثانویه احتمالی که برای پرایمر طراحی شده ممکن است تشکیل شود دایمر (dimer) است. دایمر یعنی اینکه پرایمرها بصورت تکمیل کننده هم طراحی می­ شوند (شکل 1) و به هم می­ چسبند که این موضوع اصلا برای PCR مطلوب نیست.
تشکیل دایمرها کیفیت PCR را پایین می­ آورد. این مورد را نرم افزارهای مختلف بررسی می­کند و نرم افزار به شما میگوید که پرایمرهای طراحی شده دایمر تشکیل می­دهند یانه. اگر دو پرایمر forward و Reverse تشکیل دایمر دهند cross dimer نامیده می­شود.
این ساختارها در اثر برهم‌کنش بین دو پرایمر از یک نوع رخ می‌دهند. زمانی که دو پرایمر forward و یا دو پرایمر Reverseبه هم می چسبند self dimer ایجاد می­ شود. که self dimerهایی که در انتهای ′3 تشکیل می­شوند بسیار خطرناک هستند.

همان طور که می‌دانیم، فراوانی پرایمرها در مخلوط واکنش، ‌بسیار بیشتر از ژن هدف است. در این حالت، اگر مثلا پرایمر forward طوری طراحی شود که بخشی از توالی آن، مکمل بخش دیگر باشد، در مرحله annealing، به جای اتصال به مولکول الگو،‌ به پرایمر همتای دیگر متصل خواهد شد و آنزیم نیز، رشته جدیدی را از روی آن سنتز خواهد کرد. نتیجه این امر، خارج شدن پرایمر از دسترس الگو است که به ضعیف شدن باند محصول در ژل الکتروفورز منجر می‌شود. در عوض، باندهای کوتاهی در پایین ژل الکتروفورز دیده می‌شوند که در نتیجه یک تکثیر اشتباهی ایجاد شده‌اند.

undefined

شکل 1: پرایمر دایمر از نوع cross dimer یا self dimer

اگر یک پرایمر از انتهای ′3 یا ′5 روی خودش تا بخورد تشکیل hairpin می­ دهد (شکل 2).

undefined

شکل 2: تشکیل ساختار ساقه حلقه

عمدتا نرم افزارها پایداری ساختارهای ثانویه را با عدد ΔG نشان می­ دهند. این عدد بیانگر انرژی مورد نیاز برای شکستن آن ساختار است. هرچه ΔGمنفی تر باشد ساختار پایدارتر است و باید از آن پرایمر صرف نظر کرد. ΔG بزرگتر از kcal/mol 5- عدد قابل قبول برای انواع دایمر است. برای قسمت وسط دایمرها مقدار ΔG باید بزرگتر kcal/mol 6- از باشد. عدد ΔG قابل قبول برای ساختار ثانویه Hairpin بزرگتر از kcal/mol 2- در انتهای پرایمر و kcal/mol 3- برای وسط پرایمر است.

2- توالی های تکراری (Repeats)

یکی از مواردی که در زمان طراحی پرایمر باید از آن اجتناب کرد این است که وقتی روی رشته الگو یک تکرار دیده می­شود از آن قسمت پرایمر طراحی نشود. این پارامتر نوکلئوتیدهای دوتایی تکراری را نشان می­دهد. مثلا روی رشته الگو 5′-GCATATATATATCGT-3′ را در نظر بگیرید. توالی AT چندبار تکرار شده است سعی شود از این بخش طراحی انجام نشود. توالی‌های تکراری،‌ احتمال تشکیل self-dimer را به شدت افزایش می‌دهند. یک پرایمر،‌ حداکثر مجاز به حمل 3 دی-نوکلئوتید تکراری است.

3- توالی های تکراری پشت سر هم (Run)

وقتی مشاهده می­شود که روی رشته الگو یک نوکلئوتید به تعداد زیادی تکرار شده است (بیشتر از 3 تا) نباید آن بخش را به عنوان پرایمر انتخاب کرد. به این تکرارهای پی در پی Run می­گویند. مثلا اگر سه تا G پشت سر هم تکرار شود G-Run نامیده می­شود. چنین تکرارهایی،‌ احتمال اتصال اشتباه پرایمر را افزایش می‌دهند.

005

همه چیز راجب تکنیک بلاتینگ

تکنیک بلاتینگ

تانک الکتروفورز عمودی – جداسازی و تشخیص پروتئین –

مواد لازم جهت انجام تکنیک ایمونوبلات

1- غشای نیتروسلولز با اندازه منافذ 45/0 میکرومتر یا غشای ایموبیلون (PVDF)

2- بافر انتقال حاوی تریس 25 میلی ­مولار، گلیسین 192 میلی­ مولار و متانول 15 درصد. برای تهیه آن 6 گرم تریس باز و 8/28 گرم گلیسین را در حدود یک لیتر آب مقطر حل کنید. سپس 200 میلی­ لیتر متانول اضافه کنید، حجم نهایی را با آب مقطر به 2 لیتر برسانید (PH این محلول حدود 3/8 است و نیازی به تنظیم ندارد). بافر را در یخچال قرار دهید تا قبل از استفاده خنک گردد، چون حل شدن متانول در آب گرمازاست.

3- کاغذ واتمن یا کاغذ الکتروفورز

روش آزمایش

1- مقداری از بافر تانک را در یک ظرف پلاستیکی یا شیشه­ ای تمیز بریزید. ژل را پس از بریدن بخش متراکم کننده آن حداقل 10
دقیقه در بافر قرار دهید.

نکته 1: ژل در این مدت به تعادل بافری میرسد. اگر ژل به تعادل بافری نرسد، جمع شدن آن هنگام انتقال صورت گرفته و باندهای
پروتئینی انتقال یافته به صورت اسمیر در می ­آیند. اگر بافر الکتروفورز بسیار متفاوت از بافر انتقال باشد، زمان بیشتری برای به تعادل رسیدن ژل لازم است. در ضمن باید توجه داشت که اگر درصد ژل بسیار کم باشد، قرار دادن آن به مدت طولانی در بافرانتقال ممکن است به انتشار و خروج پروتئین­ ها بیانجامد.

2- با کمک پنس و قیچی تمیز، یک ورقه از غشا به اندازه ژل ببرید. از تماس دست بدون دستکش با غشا خودداری کنید. غشا را با آب مقطر (برای غشای نیتروسلولز) یا متانول (برای غشای PVDF) خیس کنید و در ظرف حاوی بافر انتقال دهید. چندین لایه کاغذ صافی متناسب با ابعاد
ژل تهیه و همراه اسفنج­ها در بافر خیس کنید. سپس مطابق شکل زیر اجزای گفته شده را روی هم قرار دهید. این مجموعه از پایین به بالا شامل اسفنج، چند لایه کاغذ صافی، ژل، غشا، چند لایه کاغذ صافی و لایه اسفنج می­باشد. بعد از گذاشتن هر لایه، حباب­ های
هوای احتمالی را با یک میله شیشه­ ای یا لوله آزمایش از حد فاصل لایه ­ها خارج کنید.

نکته 2: اگر ژل و غشا کاملا به هم نچسبند، پروتئین­ های جدا شده از ژل بطور دقیق منتقل نمی­ شوند و به حالت اسمیر در می آیند.
در ضمن حباب هوا بین ژل و غشا از انتقال پروتئین در آن نقاط جلوگیری می کند.

undefined

شکل 5. انتقال به روش تر

3- مجموعه بلات را در قاب پلاستیکی مربوطه محکم کنید و در تانک بلات که تا ارتفاع مناسب با بافر پر شده است، قرار دهید. سپس به مدت 1-4 ساعت در شدت جریان 200-400 میلی آمپر الکتروفورز نمایید.

نکته 3: مدت زمان مطلوب راب انتقال به عواملی مثل شدت جریان، اندازه پروتئین­ ها، درصد و ضخامت ژل و ترکیب بافر (قدرت یونی، درصد متانول و وجود دترجنت­ها) بستگی دارد. هر چه وزن مولکولی پروتئین، غلظت و ضخامت ژل و درصد متانول کمتر باشد زمان کمتری برای انتقال نیاز است. به این دلیل زمان مطلوب برای انتقال تجربی است. انتقال به مدت 2 ساعت در شدت جریان 3/0 آمپر می ­تواند مبنای مناسبی برای شروع باشد.

نکته 4: دمای 25 – 15 درجه سانتی گراد در اغلب موارد برای انتقال مناسب است. در حالتی که دستگاه بلات فاقد سیستم خنک کننده است، بهتر است انتقال در سردخانه یا یخچال و یا در جریان الکتریکی ضعیف تر انجام شود. می­ توان این کار را در طول شب با ولتاژ 20- 10 ولت انجام داد.

انتخاب بافر در الکتروبلات

انتخاب بافر و استفاده از متانول در بافر بستگی به نوع پروتئین­های مورد مطالعه، شرایط ژل، نوع الکتروفورز و نوع غشا دارد. همان­گونه که قبلا ذکر شد، بافر تریس-گلیسین برای انتقال اغلب پروتئین ­ها مناسب می­ باشد. پروتئین­ ها در این بافر معمولا بار منفی دارند و به طرف آند حرکت می ­کنند. اتصال SDS به پروتئین­ ها (برای مثال در SDS-PAGE) نیز به تشدید بار منفی و حرکت آنها
کمک می­ کند. با این حال در بعضی موارد تغییر شرایط بافر تریس-گلیسین یا انتخاب بافر دیگر می­ تواند انتقال را تسهیل نماید. به عنوان مثال، تجربه نشان می­ دهد که با حذف متانول در بافر تریس-گلیسین انتقال گلیکوپروتئین­ های بزرگ به راحتی صورت می ­گیرد. متانول با زدودن SDS از پروتئین­ ها و جمع­ کردن ژل باعث کاهش انتقال این مولکول­ ها می­ شود. SDS یک دترجنت آنیونی است و در انتقال پروتئین ­ها (خصوصا پروتئین­ های با بار خالص مثبت) تاثیر­گذار می­ باشد. بنابراین در صورت نیاز، علاوه بر حذف
متانول، می­توان درصد بسیار کمی از آن را وارد بافر کرد.

انتقال در بافر CAPS50میلی مولار سریعتر صورت می­ گیرد و با تولید گرمای کمتری همراه است. بدین لحاظ در صورت لزوم می­توان از این بافر به جای تریس-گلیسین استفاده کرد. در حالاتی که بلاتینگ به هدف تعیین توالی اسیدهای آمینه در پروتئین ­ها
صورت می­ گیرد، بافر CAPS مناسب تر است؛ زیرا حضور گلیسین در بافر موجب اختلال در تعیین توالی پروتئین­ ها می ­شود.

بافر بورات سدیم 10 میلی­ مولار با PH=9.2 برای انتقال گلیکو پروتئین ­ها، پلی­ ساکاریدها و لیپوپلی­ ساکاریدها توصیه می ­شود. در
این بافر، بورات به واحدهای قندی مواد فوق متصل می­ شود و به آنها بار منفی می­ دهد.

پروتئین ­های بازی که در شرایط اسیدی الکتروفورز می ­شوند، یا پروتئین­ هایی که با تکنیک ایزوالکتروفوکوسینگ جدا می­ شوند، را می ­توان در محلول اسید­استیک 7/0درصد به غشا انتقال داد. در این شرایط پروتئین­ ها بار مثبت دارند و به طرف قطب
منفی حرکت می ­کنند.

undefined

بعد از بلاتینگ پروتئین­ ها لازم است اطلاعاتی در مورد کیفیت و کمیت باندهای انتقال یافته بدست­ آید، یا پروتئین خاصی به هدف
مطالعات بعدی (مثلا تعیین توالی) مشخص گردد.

برای این کار می­توان غشای نیتروسلولز یا PVDF را با مواد مختلف رنگ­آمیزی نمود. رنگ­ آمیزی پروتئین­ ها بسته به هدف آزمایش ممکن است به صورت قابل برگشت و یا غیر قابل برگشت باشد. پانسو-اس، جوهر­هندی، آمیدوبلک و کوماسی آبی از مواد متداول برای رنگ ­آمیزی عمومی پروتئین ­ها در غشا هستند. رنگ­ آمیزی ژل نیز کامل یا ناقص­ بودن انتقال پروتئین ­ها را نشان می­ دهد. باندهای پروتئین در ژل و غشا دقیقا هم موقعیت نمی­ باشند، زیرا ژل در طی متعادل­ سازی در محلول انتقال به دلیل وجود متانول،
مقداری کوچک می ­شود.

رنگ آمیزی قابل برگشت با پانسو- اس

محلول رنگ ­آمیزی شامل پانسو-اس 1/0 درصد وزنی- حجمی در اسید استیک 5 درصد حجمی – حجمی است. محلول آماده آن نیز توسط شرکت­ های مختلفی عرضه م ی­شود. برای رنگ آمیزی غشا را به مدت 5-10 دقیقه در مقدار کافی محلول رنگ قرار دهید. سپس با آب مقطر بشویید تا زمینه غشا بی­ رنگ گردد.

باندهای پروتئینی بعد از رنگ آمیزی به رنگ قرمز در می ­آیند. اگر شستشو با آب ادامه یابد، باندها نیز بی رنگ می­ گردند. رنگ آمیزی با پانسو-اس دخالتی در تشخیص باندها به روش اختصاصی (مثلا ایمونوبلاتینگ) یا در تعیین توالی اسیدآمینه ها ندارد. حساسیت این روش نسبتا پایین می ­باشد.

رنگ آمیزی قابل برگشت با آمیدوبلک

محلول رنگ آمیزی شامل آمیدوبلک با غلظت 01/0 درصد وزنی – حجمی در آب مقطر می ­باشد. برای رنگ ­آمیزی، غشا را 20-30 دقیقه در مقدار کافی محلول رنگ قرار دهید. سپس با آب بشویید تا زمینه غشا بی­ رنگ گردد. رنگ باندهای پروتئینی به تدریج ضعیف و بالاخره ناپدید می ­شود.

رنگ آمیزی غیر قابل بازگشت با کوماسی بلو

محلول رنگ ­آمیزی شامل کوماسی بلو R-250با غلظت 1/0 درصد وزنی حجمی در محلول اسید استیک 7 درصد حجمی- حجمی و متانول 50 درصد حجمی- حجمی در آب مقطر است.

محلول رنگ بر شامل اسید­استیک 7 درصد و متانول 50 درصد در آب مقطر است. رنگ آمیزی ژل با کوماسی بلو نیز با همین محلول­ ها صورت می­ گیرد.

غشا را 15 دقیقه در مقدار کافی محلول رنگ قرار دهید.محلول رنگ را تخلیه کرده، غشا را در محلول رنگ بر بشویید تا زمینه آبی آن بی­ رنگ گردد. سپس غشا را در آب مقطر بشویید.

کوماسی بلو برای رنگ­آمیزی پروتئین ­ها در PVDFمناسب است. این نوع رنگ را برای رنگ آمیزی نیتروسلولز بکار نبرید. زیرا زمینه آن شدیدا رنگی می ­شود.

رنگ­ آمیزی غیر قابل برگشت با آمیدوبلک

محلول رنگ ­آمیزی شامل آمیدوبلک آمیدوبلک 5/0درصد وزنی حجمی، اسید استیک 5 درصد حجمی- حجمی و متانول 50درصد
حجمی- حجمی در آب مقطر است.

محلول رنگ­بر شامل اسید استیک 5 درصد و متانول 50درصد در آب مقطر است.غشا را 5 دقیقه در محلول رنگ بر قرار دهید. محلول رنگ­ آمیزی را تخلیه کنید و غشا را با محلول رنگ­بر بشویید تا زمینه آبی رنگ شود.

رنگ آمیزی مارکرهای پروتئینی

تعیین برخی از خصوصیات پروتئین­ها همچون اندازه یا نقطه ایزوالکتریک (PI) با استفاده از مارکر­های پروتئینی صورت می ­گیرد. برای تشخیص مارکرها در غشا می­توان از روش­های زیر کمک بگیرید.

1- قسمت مربوط به مارکرها را از بقیه غشا جدا نمایید و با یکی از روش های غیر قابل برگشت که در صفحات قبل به آنها اشاره شد، رنگ­ آمیزی نمایید (PVDF را با کوماسی و نیتروسلولز را با آمیدوبلک رنگ کنید)؛ سپس این بخش از غشا را خشک نمایید و در کنار بقیه نتایج قرار دهید.

2- بسته به نوع برند موقعیت مارکرها و تعداد باندشان متفاوت است.

3- می­توان شکل بیوتینه شده مارکرها را تهیه کرد و یا مارکرها را در آزمایشگاه به بیوتین متصل نمود. تحت چنین شرایطی با در اختیار داشتن کونژوگه آویدین-پراکسیداز یا آویدین و کونژوگه آنتی­آویدین-پراکسیداز می ­توان موقعیت مارکرها را مشخص نمود.

4- آلبومین مرغی و آلبومین گاوی از پروتئین­هایی هستند که در بسیاری از انواع مارکرها وجود دارند. با در اختیار داشتن آنتی­بادی ضد این دو پروتئین به صورت کانژوگه با آنزیم (یا آنتی­بادی ضد آنها و آنتی­بادی ثانویه کانژوگه) می­ توان موقعیت آنها را در غشا تعیین ساخت. این روش زمانی قابل اجرا است که از این پروتئین­ ها به عنوان ماده مسدود­کننده در غشا استفاده نشود.

006

رفع اشکالات الکتروفورز

رفع اشکالات الکتروفورز SDS PAGE (الکتروفورز پروتئین)

تانک الکتروفورز افقی – تانک الکتروفورز عمودی – منبع تغذیه – جداسازی و تشخیص پروتئین – جداسازی و تشخیص dna –

رفع اشکالات الکتروفورز

در ذیل مشکلات روتین و معمول که برای الکتروفورز PAGE پیش می­ آید را به همراه دلیل مشکل و روش حل آن ارایه شده است.

اشکال: عدم پلیمریزاسیون یا پلیمریزاسیون ناقص

علت: پایین بودن دمای محلول­ها

راه­کار : قبل از استفاده لازم است دمای محلول به دمای محیط برسد (30 -20 سانتیگراد).

علت: کهنگی یا کم بودن مقدار کاتالیزورها مخصوصا آمونیوم پرسولفات

راه­کار : محلول تازه آمونیوم پر سولفات تهیه شود. مقدار بیشتری به ژل اضافه شود.

علت: کهنه بودن استوک اکریل آمید

راه­کار : محلول تازه اکریل آمید تهیه گردد.

علت: غلظت بالای ماده احیا کننده 2- مرکاپتواتانل

راه­کار : در صورت امکان 2- مرکاپتواتانل را در غلظت کم به ژل اضافه کنید. یا آن را در محلول ژل وارد نکنید.

علت: اثر اکسیژن هوا بخصوص در محلول­های سرد

راهکار: دمای محلول ­ها به دمای محیط برسد.

محلول ژل هواگیری شود.

اشکال: منعقد نشدن بخشی از ژل اکریل آمید در قالب شیشه­ای

علت: مخلوط نشدن آمونیوم پرسولفات در محلول ژل مخصوصا در ژل­های غلیظ

راهکار: بعد از افزودن آمونیوم پرسولفات به محلول آن را کاملا مخلوط کنید.

اشکال: جدا شدن ژل از شیشه

علت: کثیف بودن سطح شیشه

راهکار: سطح شیشه را کاملا تمیز کنید.

مشکل: چروکیده شدن ژل

علت: گرمای زیاد در هنگام الکتروفورز به دلیل مقاومت الکتریکی

راهکار: سیستم با گردش آب خنک گردد یا الکتروفورز در جریان الکتریکی کمتر و در مدت طولانی­ تر صورت گیرد.

علت: بالا بودن ضخامت یا درصد ژل در هنگام خشک کردن یا قطع جریان برق در هنگام خشک شدن ژل در دستگاه خشک کن

راهکار: قبل از خشک کردن ژل را نیم ساعت در محلول حاوی متانول 30 – 20 درصد و گلیسرول 3 درصد قرار دهید.

مشکل: چاهک­ های نامنظم و ناقص در ژل بالا (ژل متراکم کننده)

علت: محبوس شدن انتها یا کناره­ های دندانه شانه

راهکار: شانه را خارج ساخته و مجددا در در محل خود قرار دهید به نحوی که حباب هوا نداشته باشد.

علت: خارج ساختن شانه قبل از کامل شدن انعقاد ژل بالا

راهکار: پس از اطمینان از انعقاد ژل بالا اقدام به خارج کردن شانه کنید.

چاهک ها را با بافر الکترود بشویید.

مشکل: قرار نگرفتن نمونه در ته چاهک

علت: عدم وجود گلیسرول یا ساکارز در بافر نمونه

راهکار: به بافر نمونه گلیسرول یا ساکارز اضافه کنید.

مشکل: جاری شدن نمونه در چاهک­ های کناری

علت: بزرگ تر بودن ضخامت spacerها نسبت به ضخامت شانه

راهکار: در هنگام تهیه ژل از شانه مناسب استفاده شود.

علت: سر ریز شدن چاهک­ ها از نمونه

راهکار: حدود یک دوم تا یک سوم چاهک را از نمونه پروتئین بریزید.

مشکل: وجود باند قوی در ابتدای ژل جدا کننده

علت: وجود تجمعات بزرگ و نامحلول پروتئین یا لیپوپروتئین در نمونه (مخصوصا در PAGE)

راهکار: نمونه را قبل از الکتروفورز نمونه را min 15 در g 20000 سانتریفیوژ نمایید. الکتروفورز را در حضور مواد تسهیل کننده حلالیت پروتئین ها انجام دهید.

علت: وجود ژل متراکم کننده (معمولا در PAGE)

راهکار: در سیستم بافری پیوسته الکتروفورز را انجام دهید.

علت: بالا بودن درصد ژل نسبت به وزن مولکولی عده­ ای از پروتئین­ های موجود در نمونه

راهکار: در صورت امکان درصد ژل را پایین آورید. یا الکتروفورز را در ژل با شیب غلظت انجام دهید.

علت: کاهش غلظت SDS یا ماده احیا کننده (در SDS-PAGE)

راهکار: غلظت SDS یا ماده احیا کننده را در بافر نمونه افزایش دهید.

یا در صورت امکان نمونه پروتئین را رقیق کنید تا نسبت غلظت آن با SDS و ماده احیا کننده متناسب گردد.

علت: پایین بودن pH نمونه (بخصوص بعد از رسوب با تری­ کلرو استیک اسید)

راهکار: pH نمونه را تنظیم کرده یا در مقابل بافر مناسب دیالیز کنید.

قبل از الکتروفورز نمونه را min 15 در g 20000 سانتریفیوژ نمایید.

مشکل: باندهای نامنظم و مواج

علت: وجود حباب هوا در ژل

راهکار: محلول ژل را هواگیری نمایید.

علت: ناهمگونی اندازه منافذ ژل

راهکار: محلول ژل را کاملا مخلوط نمایید، مقدار آمونیوم ­پرسولفات را تنظیم نمایید تا زمان انعقاد ژل متناسب گردد.

علت: لرزش قالب شیشه ­ای در هنگام انعقاد ژل

راهکار: قالب ژل را کنار دستگاه های لرزاننده قرار ندهید.

علت: ادامه پلیمریزاسیون ژل در چاهک­ ها پس از خارج ساختن شانه

راهکار: پس از انعقاد کامل ژل بالا و خارج نمودن شانه، چاهک­ ها را با بافر الکترود شستشو دهید.

علت: بالا بودن غلظت نمک در نمونه

راهکار: نمونه را با بافر نمونه (1X) رقیق کرده یا در مقابل بافر مناسب دیالیز نمایید.

مشکل: وجود ستون­ های رنگی با باندهای نامشخص یا کاملا تفکیک نشده

علت: وجود غلظت بالای موادی همچون کلرید گوانیدیوم در نمونه

راهکار: در صورت امکان نمونه را رقیق کنید.

کلرید گوانیدیوم را با ترکیبات سازگار همچون اوره تعویض کنید.

مشکل: خطوط رنگی در مسیر الکتروفورز در ستون­ ها

علت: حل شدن تدریجی توده ­های مولکولی موجود در نمونه

راهکار: قبل از الکتروفورز نمونه را min 15 در g 20000 سانتریفیوژ نمایید.

مشکل: وجود باندهای کاذب در تمام ستون­ ها یا در سراسر عرض ژل

علت: اثر بتامرکاپتواتانول پس از رنگ آمیزی ژل با نقره آمونیاکی (به صورت دو باند منتشره در موقعیت­ های 50 و 67 کیلودالتون)

راهکار: بجای بتا مرکاپتو اتانول از DTT استفاده نمایید.

یا ژل را به روش دیگری رنگ آمیزی کنید.

علت: آلوده شدن بافر نمونه

راهکار: بافر نمونه تازه تهیه کنید.

علت: وجود ناخالصی در بافر مخزن بالا (در الکتروفورز عمودی)

راهکار: از مواد شیمیایی با خلوص و کیفیت بالا برای تهیه بافرها استفاده کنید. ترجیحا از بافرها مجددا استفاده نکنید.

مشکل: عدم تکرار پذیری نتایج الکتروفورز

علت: پروتئولیز نمونه در هنگام استخراج یا نگهداری آن

راهکار: استخراج نمونه در دمای پایین و در حضور مهارکننده­ های پروتئاز صورت گیرد.

نمونه در شرایطی نگهداری شود که دچار حداقل تغییرات گردد.

علت: متناسب نبودن مقدار SDS و یا ماده احیا کننده در بافر نمونه نسبت به پروتئین (در SDS-PAGE)

راهکار: غلظت SDS یا ماده احیا کننده را در بافر نمونه افزایش دهید.

یا در صورت امکان نمونه پروتئین را رقیق کنید تا نسبت غلظت آن با SDS و ماده احیا کننده متناسب گردد.

علت: تغییر در روش یا شرایط رنگ آمیزی

راهکار: ژل ­ها را با یک روش ثابت رنگ آمیزی کنید.

مشکل: تبلور اوره در ژل

علت: پایین بودن درجه حرارت

راهکار: الکتروفورز در دمای 15 درجه سانتی گراد انجام شود.

مشکل: ضعیف بودن باندها

علت: سرعت زیاد الکتروفورز

راهکار: ولتاژ کاهش داده شود.

یا بافر بیش از حد رقیق است. غلظت بافر افزایش داده شود.

علت: حل نشدن باندهای پروتئین

راهکار: زمان الکتروفورز طولانی­ تر شود.

یا اندازه منافذ ژل برای پروتئین­ هایی که باید جدا شوند صحیح نیست. از ژل با درصد اکریل آمید متفاوت استفاده شود.

علت: حجم نمونه بیش از حد زیاد است.

راهکار: غلظت پروتئین را افزایش دهید.

علت: ژل بیش از حد کهنه است.

راهکار: از ژل­ های تازه استفاده کنید.

مشکل: اسمیر (smear) شدن باندها

علت: ولتاژ استفاده شده بسیار زیاد است.

راهکار: ولتاژ را کاهش دهید.

علت: غلظت پروتئین بیش از حد زیاد است.

راهکار: مقدار پروتئین load شده در ژل را کاهش دهید.

علت: غلظت نمک بیش از حد زیاد است.

راهکار: نمونه­ ها را دیالیز کنید.

علت: بافر تانک کهنه است.

راهکار: بافر تانک تازه استفاده کنید.

علت: زمان رنگ بری کوتاه است.

راهکار: مدت زمان رنگ بری را افزایش دهید.

008

اصول کلی تکنیک SDS-PAGE

اصول کلی تکنیک SDS-PAGE

تانک الکتروفورز عمودی – منبع تغذیه – جداسازی و تشخیص پروتئین – الکتروفورز عمودی –

الکتروفورز

فرایند حرکت مولکول های باردار در میدان الکتریکی است. در این فرایند خصوصیات فیزیکی و شیمیایی مولکول­ ها همچون میزان بار، اندازه، شکل و شرایط محیط اطراف آنها از قبیل نگه دارنده، جنس، قدرت یونی و pH بافر، درجه حرارت و مولفه­ های میدان الکتریکی (شدت جریان، ولتاژ و زمان الکتروفورز) موثر هستند. در میان روش ­های جداسازی مولکول­ ها الکتروفورز از توسعه یافته ­ترین و متنوع ترین روش­ها است. کارایی بسیار بالای الکتروفورز در جداسازی درشت مولکول­ ها (همچون پروتئین­ ها و اسیدهای نوکلئیک) و ریز مولکول­ها و حصول روش­ های بسیار حساس در تشخیص و مشاهده اجزای جدا شده، آن را به عنوان متداول­ ترین روش پایه­ ای مورد استفاده محققین مطرح ساخته است. تانک­ های الکتروفورز عمودی ساخت شرکت دنا ژن تجهیز در مدل ­ها و اندازه­ های مختلف قابل ارایه به محققین و متخصصین می­ باشد. این شرکت همچنین مدل ­های سفارشی و ویژه را طراحی و تولید می ­نماید. طراحی تمامی مدل­ها به گونه­ ای می­ باشد که نیاز به گیره و سیستم­ های قدیمی جهت تهیه ژل را مرتفع نموده است. در واقع در درون خود دستگاه ژل تهیه می­ شود و پس از آن ژل را در محفظه تانک قرار داده و دستگاه را جهت جداسازی مولکول­ ها به منبع تغذیه متصل می­ کنند.

رفتار پروتئین در میدان الکتریکی

پروتئین­ ها مولکول­ های چند یونی هستند که بسته به pH محیط می ­توانند دارای بار مثبت، منفی و یا خنثی باشند. بار هر پروتئین به دلیل یونیزه شدن گروه ­های آمین (NH2) و کربوکسیل (COOH) در ابتدا و انتهای مولکول و زنجیر جانبی (گروه R) اسیدهای آمینه بازی و اسیدی آن است. میزان یونیزه شدن گروه ­های قابل یونیزه متاثر از غلظت یون هیدروژن (H) محیط اطراف پروتئین است. علاوه بر این گروه ­ها، وجود مولکول ­هایی مانند قندهای دارای بار منفی و بنیان اسیدهای معدنی که در بسیاری از پروتئین­ ها پس از ترجمه افزوده می ­شود نیز تا حدود کمتری در تعیین بار خالص مولکول موثر است. با توجه به تاثیر pH محیط در میزان یونیزه شدن گروه ­های اسیدی و بازی، هر پروتئین دارای یک نقطه ایزوالکتریک (pI) منحصر به خود است. نقطه ایزوالکتریک نقطه ­ای از pH است که در آن بارهای مثبت و منفی موجود در ساختمان پروتئین با هم برابر و بار خالص مولکول صفر است. برای مثال نقاط ایزوالکتریک آلبومین سرم گاوی (BSA) و لیزوزیم سفیده تخم مرغ به ترتیب معادل 7/4 و 5/10 است. اگر پروتئین در pH پایین تر از pI خود قرار گیرد بار مثبت پیدا می­ کند. در این حالت پروتئین به عنوان کاتیون (یون مثبت) عمل کرده و در میدان الکتریکی به طرف کاتد (قطب منفی) حرکت می­ کند. در حالتی که پروتئین در pH بالاتر از pI خود قرار گیرد بار منفی پیدا می­ کند و به عنوان آنیون (یون منفی)عمل می­ نماید و در میدان الکتریکی به طرف آند (قطب مثبت) می رود. بدین لحاظ اگر در محیط دارای pH بازی تحت تاثیر میدان الکتریکی قرار گیرد، به طرف قطب مثبت حرکت می­ کنند. سرعت حرکت پروتئین­ ها در این حالت (حرکت آزادانه در محیط مایع) وابسته به میزان بار منفی آنها است. در حالتی که الکتروفورز در محیط­ های نگه دارنده همچون آگارز یا پلی اکریل آمید صورت گیرد، شکل و اندازه پروتئین از دیگر عواملی هستند که میزان حرکت مولکول را تحت تاثیر قرار می­ دهند.

اگر مخلوط پروتئینی در شیب مناسبی از pH تحت اثر میدان الکتریکی قرار گیرد هر جز آن به طرف یکی از قطب­ ها تا رسیدن به pH معادل نقطه ایزو الکتریک خود حرکت کرده، سپس در آن نقطه متمرکز و از بقیه اجزا جدا می ­گردد. این موضوع اساس جداسازی پروتئین­ ها در روش ایزوالکتریک فوکوسینگ است.

نقش بافر

نوع بافر و خصوصیات آن از قبیل قدرت یونی، ظرفیت بافری و pH از عوامل بسیار اساسی در الکتروفورز محسوب می­ شوند. جداسازی مولکول­ ها در الکتروفورز در یک بافر با pH معین و قدرت یونی خاص صورت می­ گیرد. قدرت یونی بافر باید تا حد امکان پایین بوده، بطوری که سهم یون­ های نمونه در برقراری جریان به اندازه کافی بزرگ باشد. بالا بردن غلظت یونی بافر به افزایش توان الکتریکی و گرما می ­انجامد. بدین لحاظ از نظر تئوری حداقل ظرفیت بافری که بتواند شرایط pH را ثابت نگه دارد.
و اثر pH نمونه را حذف کند برای الکتروفورز کافی است.

سیستم بافری پیوسته و ناپیوسته

سیستم بافری پیوسته به سیستمی اطلاق می­ گردد که در آن ترکیب یونی و pH بافر در سراسر مسیر الکتروفورز (نمونه، ژل و بافر مخازن) مشابه است. در مقابل در سیستم بافری ناپیوسته (چند قسمتی) ترکیب یونی و pH بافر در نمونه، ژل و مخازن با یکدیگر تفاوت دارد. در سیستم ناپیوسته حتی ژل نیز شامل دو قسمت است (ژل بالا و ژل پایین). این دو قسمت علاوه بر بافر از نظر اندازه منافذ نیز متفاوت هستند.

مزیت سیستم بافری ناپیوسته در این است که کارایی الکتروفورز آنچنان متاثر از حجم نمونه نیست. در این سیستم می­توان حجم­ های بالایی از نمونه­ های رقیق پروتئین را بطور مطلوب به اجرای آن تفکیک کرد. دلیل آن این است که پروتئین­ ها در طی حرکت در ژل بالا (ژل متراکم کننده) بصورت لایه­ های بسیار نازکی در می ­آیند و سپس در ژل پایین (ژل جدا کننده) به اجزای خو تفکیک می ­شوند.

در سیستم ناپیوسته نمونه پروتئین و ژل بالا حاوی بافر تریس-هیدروکلرید با 8/6 = pH، ژل پایین حاوی بافر تریس-هیدروکلرید با 8/8 = pH و بافر مخزن (بافر الکترودها) شامل تریس-گلیسین با 3/8 = pH می­ باشد.

با وجود مزایای سیستم­ های بافری ناپیوسته، الکتروفورز بعضی از پروتئین ­ها در شرایط طبیعی در این سیستم به تولید تجمعات پروتئینی نامحلول در ابتدای ژل جدا کننده منتهی می­ گردد. این تجمعات که در اثر متراکم شدن پروتئین­ ها در ژل بالا بوجود می ­آیند به تدریج در طی آزمایش حل شده و به حرکت می­ افتند و پس از رنگ آمیزی ژل به صورت خطوط یا ستون ­های عمودی رنگی، چهره الکتروفورز را مخدوش می ­سازند. در این موارد بهتر است الکتروفورز در سیستم بافری پیوسته انجام گیرد. از مزیت­ های دیگر سیستم بافری پیوسته این است که در شرایط بافری و بخصوص pH در تمام طول ژل و زمان آزمایش ثابت می­ ماند.
این موضوع در مورد الکتروفورز پروتئین ­هایی که به تغییر شرایط حساس هستند، اهمیت دارد.

سیستم بافری پیوسته اگرچه قابلیت تفکیک کنندگی ضعیف­ تری نسبت به سیستم بافری ناپیوسته دارد، با این حال با رعایت یک سری شرایط می ­توان پروتئین­ ها را به خوبی تفکیک کرد. کاهش حجم نمونه، رعایت غلظت پروتئین با توجه به حساسیت روش رنگ آمیزی و پایین بودن قدرت یونی بافر نمونه نسبت به ژل و بافر الکترود از جمله این شرایط است.

ژل پلی اکریل آمید

ژل پلی اکریا امید یک پلی مر بی­ بار و غیر فعال از نظر شیمیایی است که ظاهری شفاف دارد و در محدوده وسیعی از pH، درجه حرارت و شرایط بافری پایدار است. این ژل از ترکیب اکریل آمید و یک ماده رابط که معمولا بیس اکریل امید (به اختصار بیس) است، شکل می­ گیرد. بدین صورت مولکول ­های اکریل آمید به صورت طولی به هم متصل می­ شوند و ماده رابط نیز مسئول تولید پل­ های عرضی متعدد بین رشته ­های اکریل آمید است.

undefined

نتیجه این واکنش تشکیل شبکه ­ای است که در آن طول رشته­ های اصلی وابسته به غلظت نسبی اکریل آمید و تراکم اتصالات عرضی وابسته به غلظت بیس اکریل آمید است. پلیمریزاسیون اکریل آمید یک واکنش رادیکالی است که توسط پراکسید شروع می­ شود. در این روش پرسولفات آمونیوم به عنوان شروع کننده و TEMED به عنوان کاتالیزور عمل می­ کنند.

اکسیژن در پلیمریزاسیون اکریل آمید اثر مهاری دارد. بدین خاطر نمی­ توان ژل اکریل آمید را همچون آگارز روی سطوح شیشه­ ای سرباز تهیه کرد. تانک های الکتروفورز عمودی ساخت شرکت دنا ژن تجهیز در مدل­ ها و اندازه های مختلف قابل ارائه به محققین و متخصصین می­باشد. شرکت همچنین مدل ­های سفارشی و ویژه را طراحی و تولید می­ نماید.
طراحی تمامی مدل­ ها به گونه ­ای می ­باشد که نیاز به گیره و سیستم­ های قدیمی جهت تهیه ژل را مرتفع نموده است. در واقع در درون خود دستگاه ژل تهیه می­ شود و پس از آن ژل را در محفظه تانک قرار داده و دستگاه را جهت جداسازی مولکول­ ها به منبع تغذیه متصل می­ نمایند.

دمای مناسب واکنش پلیمریزاسیون 30 – 25 درجه سانتی گراد است. پلیمریزاسیون در دماهای بالاتر از 50 درجه سانتی گراد اگرچه سریع­ تر صورت می­ گیرد ولی به تولید رشته ­های کوتاه اکریل آمید فاقد خاصیت الاستیکی می ­انجامد.
برای طولانی ­تر کردن زمان پلیمریزاسیون می­توان محلول ها را خنک کرد و سپس به هم افزود یا مقدار مواد شروع کننده و کاتالیزور را کم نمود. بطور معمول سرعت پلیمریزاسیون باید به حدی باشد که زمان انعقاد ژل 60 – 20 دقیقه طول بکشد.

خصوصیات فیزیکی ژل از قبیل اندازه منافذ، خاصیت الاستیکی، چگالی ژل و قوام مکانیکی متاثر از غلظت دو جز تشکیل دهنده آن است. غلظت این اجزا در ژل پلی اکریل آمید با دو فاکتور درصد T (%T) و درصد C (%C) نشان داده می­ شود. درصد T، درصد حجمی / وزنی هر دو ماده اکریل آمید و بیس را نشان می­ دهد.

undefined = %T

در صد C، درصد وزنی بیس نسبت به هر دو مونومر را نشان می ­دهد.

undefined = %C

تفاوت انواع ژل­ هایی که از یک محلول استوک اکریل آمید و بیس اکریل آمید ساخته می­ شوند تنها در درصد T انها است. زیرا با رقیق کردن محلول استوک، درصد C ثابت می­ ماند و فقط درصد T تغییر می ­کند. با ثابت ماندن درصد C، هرچه درصد T کاهش یابد، اندازه منافذ ژل بزرگ تر می­ گردد.
با ثابت ماندن درصد C، هر چه درصد T کاهش یابد اندازه منافذ ژل بزرگ­ تر می­ گردد. با این حال ژل­ های کمتر از 5/2 درصد به دلیل عدم قوام مکانیکی قابل استفاده نیستند.

مولفه­ های الکتریکی الکتروفورز

در الکتروفورز اختلاف پتانسیل یا ولتاژ (V) نیروی اصلی حرکت دهنده مولکول­ های باردار است و سرعت حرکت مولکول­ ها به مقدار آن بستگی دارد. رابطه اختلاف پتانسیل با شدت جریان (I) و مقاومت الکتریکی (R) در قانون اهم امده است:

V = IR

مقاومت الکتریکی شامل مقاومت سیم­ ها، الکترودها، ژل و بافر است. اگر در الکتروفورز مقاومت را ثابت فرض کنیم. اختلاف پتانسیل و شدت جریان نیز ثابت خواهد ماند (قانون اهم). در عمل تغییر مقاومت الکتریکی یکی از دو مولفه ولتاژ یا شدت جریان (I) دچار تغییر می­گردد. به گرمای ژول معروف است. این گرما با معادله توان قابل محاسبه است.

P توان الکتریکی
(به وات) است: P=VI

در سیستم SDS-PAGE الکتروفورز در جریان الکتریکی ثابت با بالا رفتن مقاومت الکتریکی و گرما همراه است زیرا برای ثابت ماندن جریان، اختلاف پتانسیل باید به تدریج بالا رود. در این حالت ممکن است وجود سیستم خنک کننده برای حذف گرمای تولید شده لازم باشد، چرا که الکتروفورز در جریان الکتریکی بالا ممکن است به بی ­نظمی باندهای پروتئین، سوختن ژل یا ترک خوردن شیشه ­ های اطراف ژل منجر شود.

دستگاه تانک الکتروفورز عمودی شرکت دنا ژن تجهیز به صورت پکیج کاملی که شامل محفظه تانک، مادول ران کننده ژل، درب تانک، شیشه­ ها جهت تهیه ژل، شانه، سیم رابط، فاصله اندازها (spacer)، تخته ژل و کاردک جدا کننده ژل می­ باشد. مادول ران کننده ژل به گون­ه ای می­ باشد که به صورت مستقیم ژل ریزی صورت می­ گیرد و دستگاه جهت جداسازی مولکول ها در تانک قرار می ­گیرد. ژل الکتروفورز صفحه­ ای را می ­توان به انواع عمودی و افقی تقسیم کرد. در الکتروفورز صفحه ­ای عمودی ژل بین دو صفحه شیشه­ ای قرار دارد و با مخازن بافر، از بالا و پایین در ارتباط است این نوع ارتباط باعث می­ شود تا از میدان الکتریکی اعمال شده حداکثر استفاده به عمل آید. احتمال نشت بافر و خطرات الکتریکی به ویژه در ولتاژهای بالا از مشکلات این نوع الکتروفورز است. ژل ­های صفحه ای عمودی ممکن است از چند صدم میلی متر تا چند میلی متر ضخامت داشته باشد. شرکت دنا ژن با توجه به نیاز مشتری از دستگا­ه هایی برای تهیه ژل با ضخامت های مختلف تولید می­کند.
جهت راحتی عمل تهیه ژل spacer دستگاه­ ها به صورت پیش فرض به شیشه مربعی چسبیده است. این اسپیسر دارای ضخامت 1 میلی متر می ­باشد. در صورت نیاز مشتری به spacer های با ضخامت دیگر، می­توان قبل از فرستادن دستگاه آن را سفارش داد. سیم­ های رابط دستگاه الکتروفورز عمودی به گونه­ ای طراحی شده­ اند که با کلیه منبع تغذیه ­ های روتین مورد استتفاده در آزمایشگاه قابلیت اتصال دارند. سیستم سیرکولاتور موجود در دستگاه قابلیت حفظ دمای محفظه و جلوگیری از گرم شدن دمای محفظه را دارد و نیاز به سیستم چیلر جهت خنک شدن را مرتفع می­ نماید. همراه هر دستگاه دو عدد شانه روتین تانک ­های الکتروفورز عمودی می­ باشد. اما در صورت نیاز به شانه سفارشی و یا شانه­ های بیشتر لازم است قبل از ارسال دستگاه ، با شرکت دنا ژن هماهنگ شود.

undefined

این نوع ژل­ ها و دستگاه­ ها در اندازه ­های مختلف مورد استفاده قرار می گیرند. شرکت دنا ژن انواع مدل در اندازه های مختلف را تولید می ­کند. مشخصات فنی دستگاه الکتروفورز عمودی در جدول زیر مشاهده می­ شود.

undefined

اگر الکتروفورز صفحه ای افقی در ژل پلی اکریل آمید صورت گیرد ابتدا عمل پلیمریزاسیون ژل بین دو صفحه شیشه­ ای انجام می ­ گیرد (مشابه ژل عمودی). این موضوع به دلیل حساس بودن واکنش پلیمریزاسیون به اکسیژن است. بعد از آماده شدن ژل یکی از صفحات شیشه­ ای برداشته شده سپس نمونه گذاری و الکتروفورز در حالت افقی صورت می­ گیرد. ژل ­های افقی معمولا در بافر غوطه ­ور می ­شوند و بیشتر با هدف جداسازی قطعات نوکلئوتیدی صورت می­ گیرد. ارتباط ژل و بافر در این حالت مستقیم است و الکتروفورز در زیر لایه ه­ایی از بافر صورت می­ گیرد.

مواد تسهیل کننده حلالیت پروتئین­ها در الکتروفورز

بطور کلی پروتئین­ هایی که به راحتی محلول نیستند و یا در طی آزمایش دچار واکنش ­های بین مولکولی می­ گردند و به هم می ­چسبند، در روش­های الکتروفورز به سادگی تفکیک نمی­ شوند. در چنین حالاتی افزودن موادی که به حلالیت آنها کمک نماید، اهمیت پیدا می­ کند. اوره از موادی است که برای جلوگیری از لخته شدن پروتئین­ ها و حل کردن لخته بکار می­ رود. این ماده بار الکتریکی پروتئین ها را تغییر نمی­ دهد و در غلظت­ های کم بسته به نوع پروتئین تاثیر چندانی در ساختمان پروتئین ندارد ولی در غلظت­ های بالاتر پروتئین را واسرشته می ­کند. ساختار سه بعدی بسیار از پروتئین ها در غلظت 8 مولار اوره از هم باز می ­شود. در چنین حالتی حرکت الکتروفورزی پروتئین نسبت به شکل طبیعی آن کندتر می­ گردد. این موضوع یکی از روش­ های بررسی تغییر ساختمان پروتئین است. اوره را بطور معمول به ژل متراکم کننده، ژل جدا کننده ونمونه می­ افزایند ولی آن را به بافر الکترود اضافه نمی­ کنند. غلظت اوره در ژل معمولا کمتر از غلظت ان در نمونه است (برای مثال غلظت 4 مولار در ژل­ها و 8 مولار در نمونه).

دترجنت­ ها از مواد متداول و موثر در افزایش حلالیت پروتئین­ ها بویژه پروتئین­ های غشایی هستند. این مواد در حفظ پیوندهای آبگریز بسیار کارامد هستند. این پیوندها در برهم کنش پروتئین ­ها با همدیگر و پروتئین ­ها با لیپیدها موثرند. لذا دترجنت­ ها از مهم ترین مواد در محلول سازی پروتئین­ های غشایی محسوب می­ شوند. دترجنت­ های غیر یونی را در غلظت 5 –1/0 درصد وزنی حجمی در ژل و نمونه بکار می ­برند. دترجنت ­های انیونی و کاتیونی بار الکتریکی پروتئین را تغییر می­ دهند و معمولا ساختمان آن را واسرشته می­ کنند. این دترجنت ها در شرایط طبیعی در الکتروفورز پروتئین­ ها کاربردی ندارند.

0085

پروتکل انجام تکنیک SDS-PAGE

پروتکل انجام تکنیک SDS-PAGE

تانک الکتروفورز عمودی – منبع تغذیه – جداسازی و تشخیص پروتئین – منبع تغذیه الکتروفورز – الکتروفورز عمودی –

آماده ­سازی نمونه

برای آماده ­سازی نمونه در SDS-PAGE بافر نمونه را با نسبت خاصی به نمونه می ­افزایند، سپس برای دقایقی در آب جوش قرار می­دهند. در این شرایط پروتئین­ ها به واسطه اثر SDS و ماده احیا­کننده (در حالت الکتروفورز احیایی) کاملا دناتوره می ­شوند. میزان SDS در بافر نمونه باید بارها بیشتر از میزان پروتئین باشد (میزان 3 به 1) تا کاملا از اشباع شدن پروتئین با SDS اطمینان حاصل شود.

وجود گلیسرول یا ساکارز در بافر نمونه باعث سنگین شدن نمونه و قرار گرفتن آن در ته چاهک می ­شود. این موضوع خصوصا زمانی اهمیت بالایی پیدا می­کند که مدت زمان نمونه گذاری زیاد طول بکشد.

در SDS-PAGE معمولا بعد از افزودن بافر نمونه به پروتئین و قبل از نمونه گذاری، مخلوط آنها را دقایقی (15 -20 دقیقه بسته به نوع پروتئین) در آب جوش قرار می­ دهند. حرارت موجب جداشدن زیرواحدهای پروتئین ­های چند زیرواحدی و تسهیل اشباع شدن زنجیرهای پلی­ پپتیدی با استفاده از SDS می­ شود. بعلاوه، این کار موجب غیر فعال شدن بسیاری از پروتئازها شده و امکان تجزیه پروتئین­ ها توسط آنها را از بین خواهد برد. اما با این وجود بسیاری از پروتئازها در این شرایط سالم باقی می­ مانند و لازم است مهار کننده پروتئاز به نمونه­ ها افزوده شود.

بعضی پروتئین­ ها تحت تاثیر SDS تنها، رفتاری مشابه با حالت تحت تاثیر SDS و حرارت دارند ولی بعضی پروتئین­ ها در هر حالت رفتار متفاوتی از خود بروز می­ دهند. مواد لازم جهت انجام SDS-PAGE محلول استوک اکریل­آمید (30.8 درصد):
30 گرم آکریل آمید و 0.8 گرم بیس­ اکریل ­آمید را زیر هود وزن کنید و در آب مقطر تا حجم نهایی 100 میلی لیتر حل نمایید. محلول را با کاغذ واتمن شماره 1 صاف کنید و در ظرف تیره بریزید. این محلول تا 3 ماه در یخچال قابل استفاده است.

نکته: از استنشاق پودر اکریل آمید و بیس اکریل آمید در هنگام توزین و تماس با محلول آنها خودداری نمایید.

بافر ژل پایین:‌18.2 گرم تریس باز و 0.4 گرم SDS را در 70 میلی ­لیتر آب مقطر حل نمایید. PH محلول را با اسید کلریدریک 2 مولار به 8.8 برسانید. سپس آب مقطر تا حجم نهایی 100 میلی­ لیتر اضافه کنید. غلظت تریس در این بافر 1.5 مولار است.

بافر ژل بالا: ‌6.1 گرم تریس باز و 0.4 گرم SDS را در 50 میلی لیتر­آب مقطر حل نمایید. با اسید کلریدریک 2 مولار PH آن را به 6.8 برسانید. سپس آب مقطر تا حجم نهایی 100 میلی ­لیتر اضافه کنید. غلظت تریس در این بافر 0.5 مولار است.

بافر الکترود (بافر مخازن): ‌3 گرم تریس باز، 14.4 گرم گلیسین و 1 گرم SDS را در 1 لیتر آب مقطر حل کنید، PH این بافر حدود 8.3 می­ باشد و نیاز به تنظیم ندارد.

بافر نمونه (5X): 10 میلی­ لیتر بافر ژل بالا، 5 میلی لیتر گلیسرول، 1 گرم SDS، 0.2 میلی­لیتر محلول بروموفنل بلو (0.5 درصد در اتانول) و 1 میلی­ لیتر 2-مرکاپتواتانول را در یک ظرف مخلوط نمایید. سپس با آب مقطر به حجم نمایی 20 میلی­ لیتر برسانید.

پرسولفات آمونیوم 10 درصد: 1/0 گرم پرسولفات ­آمونیوم در 1 میلی­ لیتر آب مقطر حل کنید. این محلول باید تازه تهیه شود.

تمد (TEMED) 10 درصد: ‌1/0 میلی­لیتر TEMED در 9/0 میلی ­لیتر آب مقطر حل کنید. این محلول باید به صورت تازه تهیه شود.

مارکرهای وزن مولکولی نیز آماده باشند.

انجام آزمایش

ابتدا قبل از انجام هر­گونه آزمایش باید پلیت­ ها، اسپیسرها و شانه ­ها در یک دترجنت آزمایشگاهی شسته شوند. دقت شود که از مواد خورنده جهت شست وشو استفاده نشود. در صورتی که ژل برای مراحل بعد مانند رنگ ­آمیزی با نقره مورد نیاز باشد، توصیه می­شود که شیشه ­ها را به صورت شبانه در کرومیک اسید انکوبه نمایید و سپس با آب مقطر شسته و در نهایت با اتانول، استون و اتانول به ترتیب شست وشو دهید. هیچ­گاه اجازه ندهید کرومیک اسید و یا حلال ­های آلی با ترکیبات پلاستیکی تماس داشته باشند. در نهایت شیشه ها را با دستان پوشیده شده با دستکش تمیز بردارید.

سر هم کردن پلیت­ ها (به روش الکتروفورزهای شرکت دنا ژن تجهیز)

ابتدا اسپیسر­ها و کامب­­ها را در دترجنت معمولی آزمایشگاهی پاک نمایید. در صورت نیاز به تمیزکاری اختصاصی، شیشه ­ها می­توانند به صورت شبانه در کرومیک اسید بمانند؛ سپس با آب شستشو داده شوند و دوباره با اتانول، استون و دوباره اتانول شسته شوند. هرگز اجازه ندهید حلال­ های ارگانیک و یا کرومیک اسید با اجزای پلاستیکی در تماس باشند.

undefined

پلیت­ های تمیز را با دست­های تمیز و دستکش­ دار بردارید (هرگونه اثر را نیز با استون پاک نمایید).

همانطور که در شکل زیر ملاحظه می­ کنید سرهای فضا­ساز (spacer) به دو شکل تخت و مقعر می باشد.

undefined

در صورتی که در دفعات ابتدایی به دلیل تراز نکردن درست شیشه ­ها و اسپیسر توسط کاربر، ژل از پایین اسپیسر و شیشه ­ها نشت کند می ­توان با قرار­دادن قسمت مقعر اسپیسر در پایین شیشه­ ها و زدن مقدار کمی وازلین به محل مشخص شده مطابق شکل زیر از نشتی تانک جلوگیری کرد.

سر تخت اسپیسر بدون نیاز به وازلین، در مواردی که شخص به درستی شیشه­ ها و اسپیسر را با هم تراز کرده باشد مورد استفاده قرار می ­گیرد.

آماده سازی محفظه داخلی

بدین جهت ابتدا محفظه داخلی را روی سطح تمیز قرار داده و شیشه U شکل را در محل مورد نظر گذاشته سپس دو اسپیسر در کناره­ های شیشه قرار داده می­ شود؛ سپس شیشه تخت روی آنها گذارده می­ شود. و قطعات اورینگ با پیچ­ های پلاستیکی روی آن بسته می­شود. توجه شود که نباید پیچ­ ها را در آن حالت سفت کرد بلکه محفطه را به شکل عمود روی میز قرار داده و با فشار دادن شیشه­ ها و اسپیسر از بالا با انگشت اقدام به سفت کردن پیچ­ ها می­شود.

در صورتی که این کار به درستی انجام شود، شیشه­ ها و اسپیسر با هم در یک راستا و هم سطح پایه­ های تانک قرار می ­گیرند انگشت نشانه خود را در طول لبه ­های پایینی شیشه­ ها حرکت دهید تا از تراز بودن آنها با لبه پایینی هر اسپیسر اطمینان حاصل نمایید. در این حالت کمی پیچ­ ها را محکم کرده و محفظه را به شکل افقی خوابانده و شروع به بستن کامل پیچ­ها به کمک آچار آن می­ کنیم. این عمل را برای طرف دیگر تانک نیز انجام می­ دهیم. در ادامه محفظه داخلی را به روی ژل کست قرار داده و پین­ های ژل کست را بچرخانید (از سمت O به C ). همچنان که پین­ ها را سفت می­ کنیم مقاومت زیادتر می­ شود. سپس عمل ژل ریزی را انجام داده و شانه­ ها را برای ایجاد چاهک بین فضای دو شیشه قرار می ­دهیم.

undefined

undefined

undefined

درب دستگاه را روی آن قرار دهید و کابل­ های پاور به طور صحیح وصل نمایید. ابتدا مطمین شوید که دستگاه پاور سوپلای خاموش می­باشد؛ حالا سیستم جهت ران شدن آماده است.

ریختن ژل پایین (ژل جدا کننده)

محلول ژل پایین را از اجزای آن با توجه به درصد آن تهیه نمایید. نحوه تهیه 12 میلی­لیتر از محلول ژل پایین در جدول زیر آمده است.

undefined

جدول 2. تهیه 12 میلی ­لیتر محلول ژل پایین با غلظت­های مختلف

اجزای ژل پایین به غیر از TEMED را در یک ظرف مناسب مخلوط نمایید. محلول را حدود 30 ثانیه با پمپ خلا از هوا تخلیه کنید. سپس TEMED را اضافه کنید. پس از هم زدن سریع، محلول را در بین شیشه­ ها تا ارتفاع مناسب بریزید. باید دقت شود که حدود 3 سانتیمتر فضا برای ژل بالا لازم می­باشد.
حدود 0.5 میلی­لیتر آب مقطر با سمپلر به آرامی از کنار شیشه روی سطح ژل بریزید، به نحوی که با ژل مخلوط نگردد. انعقاد ژل پایین معمولا 15-45 دقیقه طول می کشد. ژل منعقد شده به وضوح از آب مقطر روی آن (به دلیل تفاوت در ظریب شکست نور) قابل تشخیص می باشد.

ژل بالا (ژل متراکم کننده)

بعد از انعقاد ژل پایین، مطابق جدول زیر ژل بالا را تهیه نمایید.

undefined

جدول 3. تهیه 5 میلی لیتر محلول ژل بالا با غلظت های 3 ، 4 و یا 5 درصد

معمولا غلظت این ژل 3، 4 و یا 5 ٪ است. اجزای ژل بالا غیر از TEMED را در ظرف مناسبی مخلوط کنید. آب روی ژل پایین را کاملا خالی کنید. برای حذف قطرات باقیمانده آب، حدود 1 میلی­ لیتر محلول ژل بالا را در جدار داخلی شیشه بگردانید و مجددا تخلیه نمایید. به بقیه محلول ژل بالا TEMED اضافه نمایید و پس از هم زدن سریعا تا ارتفاع مناسب روی ژل پایین بریزید؛ سپس شانه را با دقت در ژل بالا فرو کنید، به طوری که دندانه­ های آن حدود 1.5 سانتی متر از سطح ژل فاصله داشته باشند. معمولا ژل بالا در کمتر از 15 دقیقه می ­بندد (کناره دندانه­ های شانه از ژل منعقد شده قابل تشخیص است). بهتر است قبل از دو آوردن شانه­، انتهای دندانه آن را روی شیشه با ماژیک مشخص کنید تا نمونه­ گذاری و تشخیص چاهک­ ها راحت باشد.

آماده سازی جهت ران

پس از بسته شدن ژل بالا، شانه ها را از آن خارج نموده و دستگاه را به دورن تانک قرار دهید. مخازن تانک و دستگاه را تا ارتفاع مناسب به ترتیب با بافر الکترود
و بافر نمونه پر کنید. هر گونه حباب در انتهای ژل را با تزریق بافر توسط سرنگ خارج نمایید.

افزودن نمونه ها

یک حجم بافر نمونه (5 X) را به 4 حجم نمونه پروتئین اضافه نمایید. اگر پروتئین به صورت پودر است، مقدار مورد نیاز آن را در بافر نمونه که 5 بار با آب مقطر رقیق شده (بافر 1 X) ، حل کنید. نمونه و بافر نمونه را در یک ظرف کوچک درب­ دار ریخته و به مدت 5 دقیقه در ظرف آب جوش قرار دهید. در صورت کدورت نمونه و یا وجود ذرات نامحلول، آن را به مدت 10 دقیقه در دور 10/000 g. سانتریفیوژ نمایید. سپس با سرنگ هامیلتون یا سمپلر مناسب 10-20 میکرولیتر از هر نمونه را به دقت در چاهک بریزید. به دلیل وجود گلیسرول، نمونه در ته چاهک قرار می ­گیرد. مقدار پروتئین موجود در هر چاهک به میزان خلوص نمونه و روش رنگ ­آمیزی بستگی دارد.

حالا سیم ­های رابط را به الکتروفورز وصل نمایید و برای الکتروفورز در جریان الکتریکی ثابت، شدت جریان 20-30 میلی آمپر را تنظیم نمایید. در این حالت رنگ نشان­گر (بروموفنل بلو) طی مدت 1.5 تا 2 ساعت به انتهای ژل می­رسد.

پس از اتمام عمل الکتروفورز، جریان را قطع نمایید و دستگاه را از تانک بیرون آورید. سپس پیچ های آن را شل نمایید و شیشه­ های حاوی ژل را با دقت بردارید. با استفاده از کاردک همراه دستگاه به آرامی شیشه­ ها را از هم جدا کنید و ژل را برداشته. در صورت لزوم ژل را رنگ آمیزی کنید.

رنگ ­آمیزی

رنگ­ آمیزی پروتئین­ ها در ژل پلی­ اکریل­آمید با روش ­های متنوعی امکان­ پذیر است. کوماسی بلو (انواع R و G)[1] و نقره از پر استفاده ترین مواد برای رنگ آمیزی پروتئین­ ها هستند. در اینجا رنگ ­آمیزی با کماسی ­بلو که بسیار متداول می­باشد، توضیح داده می­شود.

رنگ­ آمیزی با کوماسی بلو R-250

کوماسی بلو R-250 معمول­ترین رنگ برای رنگ آمیزی پروتئین­ ها است. سادگی رنگ­ آمیزی، هزینه کم، ثبات رنگ برای مدت طولانی و حساسیت نسبتا بالا از مزایای آن می ­باشند.
حساسیت این روش 0.5-0.2 میکروگرم پروتئین در هر باند می­باشد. در این روش مراحل تثبیت و رنگ­ آمیزی پروتئین ­ها به طور هم­ زمان صورت می­ گیرد.

undefined

شکل 7. حمام رنگ جهت رنگ آمیزی پروتئین­ ها در ژل اکریل آمید

مواد

· محلول رنگ ­آمیزی: 0.25 گرم کوماسی بلو R-250 را در 125 میلی لیتر متانول حل کنید. سپس 25 میلی­ لیتر اسید استیک گلاسیال و 100 میلی­لیتر آب مقطر اضافه نمایید. غلظت رنگ در این محلول حدود 0.1 درصد وزنی/حجمی است. قبل از استفاده محلول رنگ را با کاغذ واتمن شماره 1 صاف کنید. این محلول می­تواند به عنوان تثبیت­ کننده پروتئین­ ها نیز عمل کند.

· محلول رنگ­ بر: 200 میلی­لیتر متانول، 100 میلی­لیتر اسید­استیک گلاسیال و 700 میلی­ لیتر آب مقطر را به هم بیفزایید.

روش رنگ ­آمیزی

· ژل را در ظرف درب دار قرار دهید. حجم کافی از محلول رنگ (م ثلا 100 میلی­ لیتر برای یک ژل کوچک) اضافه کنید. در ظرف را بسته و آن را 1-2 ساعت روی شیکر قرار دهید. این مدت زمان برای رنگ­ آمیزی ژلی با غلظت 10 ٪ و ضخامت 1 میلی لیتر کافی است.

· محلول رنگ را تخلیه کنید. ژل را کاملا با آب معمولی شسته، سپس محلول رنگ بر اضافه کنید. در ظرف را بسته، آن را روی شیکر قرار دهید. پس از تیره شدن محلول رنگ بر، آن را با محلول تازه تعویض کنید. این عمل را چند بار تکرار کنید تا زمینه ژل شفاف گردد و باندهای پروتئینی به وضوح مشاهده شوند.

· ژل را در محلول 7 درصد اسید­استیک قرار دهید و در ظرف را ببندید. ژل در این حالت برای مدت طولانی قابل نگهداری است.

تعیین وزن

در تکنیک SDS-PAGE مولکول­ های پروتئینی با استفاده از سدیم دودسیل سولفات به صورت خطی در می ­آیند و حرکت آنها بر اساس وزن می­باشد. همان گونه که پیش­تر نیز ذکر شد، مسافت طی شده پروتئین­ ها با لگاریتم وزن مولکولی آنها رابطه خطی دارد. پس هرچه پروتئین بزرگتر باشد مسافت طی شده کمتر خواهد بود.

به طور معمول در زمان بارگیری نمونه ها، در یکی از چاهک ­ها مارکر پروتئینی نیز اضافه می­ کنند. مارکرهای پروتئینی متشکل از چندین پپتید با وزن مولکولی مشخص می­ باشند. با مقایسه نمودن میزان حرکت پروتئین مورد نظر بر روی ژل با مارکر­های پروتئینی با استفاده از رسم نمودار حرکت نسبی می­توان وزن مولکول هدف را تخمین زد.

undefined

شکل 8. مارکر مورد استفاده در تکنیک SDS-PAGE به همراه پروتئین­ های مورد بررسی