آزمایش pcr چیست؟

تصور کنید تنها با چند سلول یا قطره خون،  بتوانیم وجود یک ویروس یا جهش ژنتیکی را در بدن خود شناسایی کنیم؛ این اتفاق در دنیای امروزه توسط آزمایش PCR انجام می‌شود. PCR یا واکنش زنجیره‌ای پلیمراز، یکی از مهم‌ترین کشف‌های زیست‌شناسی مولکولی است که انقلابی در دنیای تشخیص بیماری‌ها و تحقیقات ژنتیکی ایجاد کرد.  در این مقاله توسط تیم تحقیقاتی دناژن، با مراحل انجام تست PCR، انواع روش‌ها، خطاهای احتمالی و نقش حیاتی ترموسایکلر آشنا می‌شویم.

آزمایش PCR چیست؟

PCR (واکنش زنجیره‌ای پلیمراز) روشی دقیق برای شناسایی و تکثیر DNA یا RNA است. این آزمایش از مقدار بسیار کم ژنتیک، میلیون‌ها نسخه تولید می‌کند که به آن «فتوکپی مولکولی» هم گفته می‌شود. واکنش PCR با آنزیم Taq polymerase انجام می‌شود و شامل چرخه‌های دناتوراسیون، اتصال پرایمر و تکثیر DNA است. دستگاه ترموسایکلر با کنترل دقیق دما، این چرخه‌ها را به‌صورت خودکار اجرا می‌کند و نتایج قابل اعتماد و تکرارپذیر ارائه می‌دهد.

مراحل انجام آزمایش PCR

مراحل انجام تست PCRدر آزمایشگاه، برای تشخیص ژنتیکی و شناسایی DNA یا RNA پاتوژن‌ها، مانند ویروس‌ها و باکتری‌ها به کار می‌رود. PCR در چند مرحله تکرارشونده و دقیق انجام می‌شود. این چرخه‌های گرم و سرد توسط ترموسایکلر به‌صورت خودکار مدیریت می‌شود تا نمونه‌ها آماده تکثیر شوند و DNA یا RNA هدف تقویت شود.

1. آماده‌سازی نمونه

در مرحله آماده‌سازی نمونه (Sample Preparation) برای PCR ، کیفیت مواد ورودی و نحوه کار کردن در آزمایشگاه، نقشی بسیار تعیین‌کننده‌ در موفقیت یا شکست PCR دارد. بسیاری از شکست‌ها  به همین مرحله بستگی دارند.

خطاهای رایج در مرحله آماده‌سازی

اشتباهات متداول عبارت هستند از:

1.  آلودگی نمونه: تست PCR آزمایش بسیار حساسی است. حتی مقدار کمی DNA خارجی یا آلودگی می‌تواند باعث ایجاد نتایج اشتباه شود برای جلوگیری از آن، پاکسازی سطوح با ضدعفونی‌ کننده‌ها یا UV، استفاده از ناحیه‌های جدا برای pre-PCR و post-PCR یا استفاده از سر جدید برای هر نمونه، توصیه می‌شود.

2. وجود ناخالصی در DNA/RNA: استفاده از نمونه‌های ناخالص، یا آن‌هایی که آلوده به مهارکننده‌هایی مانند نمک‌ها، فنول یا پروتئین‌ها هستند، می‌توانند عملکرد DNA پلیمراز را کاهش دهند یا متوقف کنند.

3.  استخراج ناکافی DNA/RNA: تخریب یا استخراج نامناسب الگو بر اثر نور، حرارت یا فعالیت RNase، موجب می‌شود که الگوی کافی برای تکثیر در PCR فراهم نباشد.

تاثیر کیفیت استخراج DNA/RNA روی PCR

کیفیت استخراج بالای استخراج برابر با موفقیت تست PCR است. همان‌طور که سایت wellbeingmagazine اشاره می‌کند:

“Check DNA purity with spectrophotometry — a suitable A260/A280 ratio (~1.8 for DNA, ~2.0 for RNA) with minimal residual chemical contaminants promotes reliable amplification by DNA polymerase.”

«خلوص DNA را با اسپکتروفوتومتری بررسی کنید، نسبت A260/A280 مناسب است (حدود 1.8 برای DNA و 2.0 برای RNA) و وجود حداقل مواد شیمیایی باقیمانده، باعث تقویت قابل اعتماد توسط آنزیم DNA پلیمراز می‌شود.»

بهترین روش کاهش خطا، استفاده از دستگاه‌های اتوماتیک استخراج DNA/RNA است. با استفاده از دستگاه اتوماتیک استخراج DNA دناژن، مراحل حساس و پیچیده مانند افزودن بافرها، شستشو و جمع‌آوری DNA به‌طور دقیق و تکراری انجام می‌شوند. نمونه‌ها در مسیرهای جداگانه و محیط بسته حرکت می‌کنند و ریسک انتقال DNA از یک نمونه به نمونه دیگر کاهش می‌یابد.

چرا بسیاری از PCRها در همین مرحله Fail می‌شوند؟

• یکی از مهم‌ترین عوامل شکست، وجود مهارکننده‌ها در نمونه است. باقی‌مانده‌های استخراج، مانند پروتئین‌ها، نمک‌ها یا فنول، می‌توانند فعالیت DNA پلیمراز را مهار کرده و فرآیند تکثیر را مختل کنند.
• وجود مقدار نامناسب الگو (Template) نیز می‌تواند بازده PCR را کاهش دهد.
• آلودگی یا خطاهای انسانی در هنگام آزمایش می‌تواند باعث شکست نتایج PCR شود.

2. دناتوراسیون (Denaturation)

در این مرحله، DNA دو‌رشته‌ای، در دمای بالا از هم جدا می‌شود تا الگوی تکثیر در دسترس ما قرار گیرد.

3. اتصال پرایمر (Annealing)

اتصال اختصاصی پرایمرها به DNA هدف که نقش تعیین‌کننده‌ای در صحت نتیجه PCR دارد.

4. تکثیر سازی (Extension)

آنزیم DNA پلیمراز با استفاده از پرایمرها، رشته جدید DNA را سنتز می‌کند.

3 مراحله اصلی دناتوراسیون، اتصال پرایمر و گسترش در آزمایش PCR، به‌صورت کامل و مرحله‌به‌مرحله در مقاله « PCR چیست و مراحل انجام واکنش پلیمراز» مورد بحث قرار گرفته‌اند.

نحوه انجام تست PCR در عمل

PCR یک تکنیک آزمایشگاهی است که در RT‑PCR ابتدا RNA به cDNA تبدیل می‌شود.

مراحل اصلی تست

مرحله‌های آزمایشگاهی-عملی این تست عبارتند از:

1. استخراج DNA/RNA
2. آماده‌سازی مخلوط PCR
3.  قرار دادن نمونه در لوله‌ها
4.  اجرای برنامه دمایی در ترموسایکلر
5. تحلیل نتایج آزمایش

خطاهای تست و نحوه مدیریت

وجود اشتباهات در اجرای تست می‌تواند ناشی از منابع مختلفی باشد، و باید از قبل برای آن برنامه‌ریزی شود.

 کنترل مثبت و منفی: قرار دادن نمونه‌های کنترل در هر صفحه آزمایش کمک می‌کند مشکلات PCR، مثل آلودگی یا عملکرد نادرست، سریع تشخیص داده شود.

 تکرار نمونه‌ها : اجرای چندباره یک نمونه، اثر خطاهای تصادفی در حجم‌برداری یا مراحل دیگر را کاهش می‌دهد و پراکندگی نتایج را کنترل می‌کند.

شناخت منابع خطا: راهنمای MIQE یادآوری می‌کنند که خطاها می‌توانند از پروتکل، کار اپراتور یا شرایط نگهداری نمونه‌ها ناشی شوند.

نحوه بررسی PCR استاندار

در استانداردهای PCR مانند MIQE، 3 مفهوم کلیدی برای اطمینان از کیفیت نتایج وجود دارد:

1. Repeatability: اگر یک نمونه تحت همان شرایط و همان روش چندین بار آزمایش شود، نتایج به هم نزدیک خواهند بود.
2. Reproducibility: یعنی نتایج وقتی توسط اپراتور مختلف، روزهای مختلف یا حتی آزمایشگاه‌های مختلف تکرار می‌شود، قابل مقایسه و هم‌راستا باشد.
3. Consistency (ثبات در طول زمان): هنگام اجرای روش آزمایشی در بازه‌های زمانی طولانی، نتایج نباید به‌طور ناگهانی تغییر کنند و خطاهای غیرمنتظره باید به حداقل برسند.

نقش دستگاه ترموسایکلر در کاهش Variability

وجود دستگاه ترموسایکلر نقشی ضروری در کاهش نوسان (Variability) نتایج PCR دارد. سایتNature  اشاره می‌کند:

 “In theory, every cycle in PCR represents a doubling of the DNA templates, but if temperature is not perfectly controlled, then doubling efficiency is compromised.”

«PCR بر پایه تغییرات دمایی بسیار دقیق و حساس بین مراحل است. اگر این دماها به‌درستی و با تکرار بالا، کنترل نشوند، بهره تکثیر کاهش یافته و نتایج ناسازگار می‌شوند».

کنترل  (Ramp Rate) در PCRبر روی دقت و کارایی واکنش تأثیر بسیاری دارد. دستگاه‌های پیشرفته این سرعت را دقیق کنترل می‌کنند تا نتایج قابل اعتمادتر و تکرارپذیرتر باشند. همچنین ژنراتورهای دمایی پیچیده در ترموسایکلرها، باعث می‌شوند که تغییرات دمایی دستی حذف شود و خطاهای ناشی از کنترل دستی دما رخ ندهد. برای دستیابی به نتایج PCR دقیق و قابل اعتماد، خرید ترموسایکلر را به شما پیشنهاد می‌کنیم.

انواع روش آزمایش PCR

با گسترش نیازهای آزمایشگاهی، نسخه‌های مختلفی از آزمایش PCR توسعه یافته‌اند که هرکدام برای هدف خاصی طراحی شده‌اند و تفاوت آن‌ها در نحوه طراحی واکنش، نوع آنالیز و سطح حساسیت است. انتخاب نوع مناسب PCR به عواملی گوناگونی بستگی دارد. مقایسه و نتایج به‌دست آمده توسط تیم متخصص دناژن، به پژوهشگران و متخصصان کمک می‌کند تا دستگاهی متناسب با نیاز خود انتخاب کنند.

PCR معمولی (Conventional PCR)

PCR استاندارد نسخه پایه‌ای PCR است که در هر واکنش تنها یک هدف ژنتیکی را تکثیر می‌کند و محصول نهایی با ژل الکتروفورز بررسی می‌شود. از این روش برای تشخیص وجود یا عدم وجود یک ژن خاص، آزمایش‌های روتین و تحقیقات پایه‌ای که نیاز به کمی‌سازی دقیق ندارند، استفاده می‌شود.

 دستگاه PCR معمولی چرخه‌های دناتوراسیون، آنیلینگ و اکستنشن را با کنترل دقیق دما اجرا می‌کند و بازده واکنش را بهینه می‌سازد. حساسیت بسیار بالا ضروری نیست و از گرادینت برای بهینه‌سازی اولیه استفاده می‌شود.

Real‑Time PCR یا qPCR

سایت flow-robotics اشاره می‌کند که در دستگاه qPCR (Quantitative PCR)، محصول DNA هم در پایان واکنش و هم در طول تکثیر، همزمان اندازه‌گیری می‌شود.

استفاده از این نوع دستگاه در موارد زیر صورت می‌گیرد:

• تشخیص عفونت‌های کلینیکی با حساسیت بالا
• زمانی‌که نیازمند پیگیری دقیق تغییرات Gene Expression (فعالیت یک ژن و میزان تولید RNA یا پروتئین از آن)

دستگاه qPCR باید دمای یکسان را در همه چاهک‌ها حفظ کند و فلورسانس را به‌صورت بلادرنگ و با حساسیت بالا در هر چرخه اندازه‌گیری کند. همچنین توانایی تحلیل منحنی تقویت و ارائه مقدار دقیق DNA یا RNA را داشته باشد. کیفیت و ثبات گرمایش و سردسازی ترموسایکلر در qPCR حیاتی است، زیرا حتی تغییرات جزئی دما می‌تواند نتایج را تحت تأثیر قرار دهد.

Nested PCR

Nested PCR نسخه‌ای پیشرفته از PCR کلاسیک است که برای افزایش حساسیت طراحی شده و شامل دو مرحله پشت‌سرهم می‌باشد:

PCRاول با پرایمرهای خارجی: در این مرحله یک محصول بزرگ‌تر تولید می‌شود که شامل هدف مورد نظر است تا DNA اولیه تقویت شود، حتی ممکن است محصول کمی غیر اختصاصی باشد.

PCR دوم با پرایمرهای داخلی: پرایمرهای داخلی به‌طور دقیق داخل بخش هدف قرار می‌گیرند و آن بخش را تقویت می‌کنند، در نتیجه دقت آزمایش افزایش یافته و تولید محصولات غیر اختصاصی کاهش می‌یابد.

چالش‌ها و محدودیت‌ها:

امکان آلودگی متقاطع بین دو مرحله PCR، به‌ویژه در مرحله دوم، که می‌تواند باعث نتایج مثبت کاذب شود.

Multiplex PCR

Multiplex PCR روشی است که در آن چند جفت پرایمر مختلف هم‌زمان در یک لوله واکنش قرار می‌گیرند تا چندین هدف ژنتیکی به صورت همزمان تکثیر شوند. این روش برای بررسی چند ژن یا ناحیه ژنتیکی، شناسایی چند پاتوژن و صرفه‌جویی در زمان و مواد مصرفی کاربرد دارد.

چالش‌های اصلی Multiplex PCR:

• تنظیم دمای آنیلینگ: دما باید بهینه باشد تا همه پرایمرها به درستی به هدف متصل شوند.
• دمای پایین: باعث اتصال‌های غیر اختصاصی و تولید محصولات ناخواسته می‌شود.
• دمای بالا: ممکن است برخی پرایمرها به هدف متصل نشوند.

انواع روش نمونه‌گیری PCR

در تست PCR، نوع نمونه‌گیری و کیفیت نمونه از اهمیت بسیار بالایی برخوردار هستند، زیرا مقدار و کیفیت     DNA/RNA  موجود در نمونه، دقت و میزان اعتبار نتیجه PCR را تعیین می‌کند.

نمونه سواب (حلق، بینی، دهانه رحم)

نمونه سواب برای جمع‌آوری سلول‌ها و ترشحات مخاطی به‌کار می‌رود و در تشخیص عفونت‌های تنفسی و مقاربتی کاربرد دارد.

خطاهای رایج روش سواب شامل:

• اگر زمان یا تکنیک نمونه‌گیری به‌درستی رعایت نشود و سواب به اندازه کافی در محل مناسب قرار نگیرد، مقدار RNA یا DNA جمع‌آوری‌شده کم خواهد بود و ممکن است نتیجه منفی کاذب ایجاد شود.
•  استفاده از سواب نامناسب (مانند سواب‌های چوبی یا دارای الیاف خاص) می‌تواند باعث ورود مهارکننده‌های PCR به نمونه شود و عملکرد آنزیم را مختل کند.
• نگهداری نادرست نمونه نیز اهمیت زیادی دارد؛ سواب باید بلافاصله در محیط انتقال مناسب (مانند VTM بدون مهارکننده) قرار گیرد، در غیر این صورت ماده ژنتیکی تخریب شده و نتیجه آزمایش تحت تأثیر قرار می‌گیرد.

نمونه خون

در تست PCR، از خون کامل یا اجزای آن مانند پلاسما برای شناسایی علل مولکولی، بررسی بار ویروسی یا تشخیص ژن‌های خاص استفاده می‌شود.

خطاهای رایج در گرفتن نمونه خون، عبارت هستند از:

•  خون فقط حاوی DNA یا RNA نیست؛ مواد دیگری مثل هموگلوبین، پروتئین‌ها و ترکیبات شیمیایی هم دارد. اگر این مواد در مرحله استخراج به‌خوبی حذف نشوند، می‌توانند جلوی فعالیت آنزیم DNA پلیمراز را بگیرند. در این حالت، PCR یا انجام نمی‌شود یا محصول ضعیفی ایجاد می‌کند.

نمونه بافتی

نمونه بافتی از طریق بیوپسی یا جراحی تهیه می‌شود و برای تشخیص مولکولی بافت‌های عفونی یا توموری بیمار مورد استفاده قرار می‌گیرده و امکان بررسی مستقیم تغییرات ژنتیکی داخل بافت را فراهم می‌کند.

این روش دارای پیچیدگی‌هایی است. از جمله:

1- آماده‌سازی نمونه: بافت‌ها ساختار فشرده و پیچیده‌ای دارند و DNAها داخل سلول‌ و بافت بدن محصور شده است؛ به همین دلیل، برای آزادسازی اسیدهای نوکلئیک، مراحل استخراج طولانی‌ و دقیق‌تری نیاز است.

2- وجود مهارکننده‌های طبیعی در بافت: بافت‌ها ممکن است حاوی آنزیم‌ها، پروتئین‌ها یا ترکیبات طبیعی باشند که می‌توانند واکنش PCR را مهار کنند.

3- اهمیت کنترل دما در PCR: از آنجا که مقدار و کیفیت DNA/RNA در نمونه‌های بافتی متغیر است، کنترل دقیق دمای PCR اهمیت زیادی دارد. دمای نامناسب می‌تواند باعث تخریب الگو، دناتوراسیون ناقص یا تکثیر غیر اختصاصی شود.

نمونه مایعات بدن

مایعات بدن مانند ادرار، مایع مغزی‌-نخاعی (CSF) و سایر مایعات بیولوژیک می‌توانند به‌عنوان نمونه برای آزمایش PCR استفاده شوند.

ویژگی‌ها و چالش‌های این از نمونه گیری شامل:

•  مقدار کم ماده ژنتیکی: در بسیاری از مایعات بدن، مقدار DNA یا RNA هدف نسبت به نمونه‌هایی مانند خون یا سواب کمتر است. به همین دلیل، PCR باید حساسیت بالایی داشته باشد تا بتواند حضور عامل بیماری‌زا یا ژن موردنظر را به‌درستی تشخیص دهد.

نگاهی سریع به مقایسه روش‌های نمونه‌گیری

جدول زیر روش‌های مختلف نمونه‌گیری در PCR و تفاوت‌های کلیدی آن‌ها را نشان می‌دهد.

نقش ترموسایکلر در تست PCR

ترموسایکلر نقش محوری و تعیین‌کننده در کیفیت نتایج PCR دارد، زیرا PCR یک چرخه دقیق تغییرات دما است که باید قابل تکرار و کنترل‌شده انجام شود.

برای تکثیر موفق DNA، مراحل دناتوراسیون، اتصال پرایمر و گسترش باید با دقت بسیار بالا صورت گیرد. دمای نامناسب می‌تواند باعث کاهش بازده، تولید محصولات نامتناسب یا نتایج ناپایدار شوند.

ترموسایکلردناژن، با اجرای دقیق چرخه‌های حرارتی، یکنواختی و تکرارپذیری، نتایج پایدار آزمایش را تضمین می‌کند. این موضوع به‌ویژه در qPCR اهمیت دارد، زیرا تحلیل منحنی تکثیر برای تعیین مقدار DNA/RNA به دقت حرارتی وابسته است.

اشتباهات رایج هنگام آزمایش

این خطاها از مشکلات متداولی هستند که در آزمایشگاه‌ها تجربه می‌شوند و می‌توانند باعث Fail  شدن آزمایش یا نتایج اشتباه شوند:

1. انتخاب نادرست دمای Annealing: اگر دمای اتصال پرایمر بسیار بالا باشد، پرایمرها به الگو اتصال پیدا نمی‌کنند و درنتیجه تکثیر اتفاق نمی‌افتد. اگر دما بسیار پایین باشد، پرایمرها محصولات غیر اختصاصی تشکیل می‌شود. بهینه‌سازی این دما با تست گرادیان برای هر جفت پرایمر ضروری است.

2. استفاده از دستگاه یا تجهیزات نامناسب: ترموسایکلرهای قدیمی یا غیر کالیبره ممکن است توانایی کنترل دما را به‌صورت یکنواخت در همه چاهک‌ها نداشته باشند. این اختلاف دمایی می‌تواند باعث تکرارپذیری ضعیف و اختلاف در نتایج شود.

3. در هنگام تفسیر نتایج PCR، باندهای غیر اختصاصی یا پرایمر-دایمرها در ژل الکتروفورز و پیک‌های غیرمنتظره در منحنی ذوب، ممکن است به اشتباه به عنوان سیگنال واقعی شناسایی شوند. به‌کارگیری کنترل‌های مثبت و منفی به شناسایی و جلوگیری از چنین خطاهایی کمک می‌کند.

‌ PCR، اولین انتخاب در تشخیص بیماری‌

PCR به‌واسطه حساسیت بالا و سرعت اجرا، در بسیاری از آزمایشگاه‌ها اولین انتخاب برای تشخیص مولکولی است. این روش با مقادیر بسیار کم DNA یا RNA عامل بیماری را قبل از ظهور علائم بالینی شناسایی می‌کند، به‌طور مستقیم ماده ژنتیکی ویروس، باکتری یا جهش ژنتیکی را هدف قرار می‌دهد.

جدول کاربرد‌های PCR در انواع بیماری

آزمایش PCR کاربرد‌های فراوانی در تشخیص بیماری‌ها نیز دارد. جدول زیر نمونه‌ای از انجام آزمایش‌های متعدد در آزمایشگاه است.

جمع‌بندی

PCR یکی از ابزارهایی است که امکان شناسایی زودهنگام عوامل بیماری‌زا و تغییرات ژنتیکی را فراهم می‌کند. موفقیت آزمون به نمونه‌گیری، خلوص DNA/RNA و اجرای دقیق چرخه‌های دمایی ترموسایکلر بستگی دارد. کنترل پایدار دما توسط ترموسایکلر از نتایج ناپایدار و خطاهای تفسیر جلوگیری می‌کند، به‌همین دلیل در عمل آزمایشگاهی، کیفیت اجرای PCR و عملکرد دستگاه نقش مهم‌تری از خود کیت دارد.